Структурно-функциональная характеристика клеточной мембраны
Клеточная мембрана (оболочка клетки) представляет собой тонкую (6 нм) липопротеиновую пластинку, содержание липидов в которой составляет около 40%, белков— около 60%. Изнутри клеточная мембрана выстлана тонким, более плотным слоем гиалоплазмы, практически лишенной органелл. На внешней поверхности мембраны имеется небольшое количество (5 — 10%) углеводов, молекулы которых соединены либо с белками (гликопротеи-ды), либо с липидами (гликолипиды) и образуют гликокаликс. Углеводы участвуют в процессах рецепции биологически активных веществ, реакциях иммунитета. Структурную основу клеточной мембраны (матрикс) составляет бимолекулярный слой фосфолипидов, являющихся барьером для заряженных частиц и молекул водорастворимых веществ. Липиды обеспечивают высокое электрическое сопротивление мембраны нейрона — до 1000 Ом/см2
.
Молекулы фосфолипидов мембраны состоят из двух частей: одна из них несет заряд и гидрофильна, другая — не заряжена и гидрофобна. Это определяет способность липидов самопроизвольно образовывать двухслойные мембранные структуры под влиянием собственных зарядов. В клеточной мембране заряженные гидрофильные участки молекул фосфолипидов от одних молекул направлены внутрь клетки, а от других — наружу. В толще клеточной мембраны молекулы фосфолипидов взаимодействуют незаряженными гидрофобными участками (они «спрятаны» от внутриклеточной и внеклеточной воды). В липидном слое клеточных мембран содержится много холестерина. Обмен липидов в отличие от белков происходит медленнее. Однако возбуждение нейронов мозга приводит к уменьшению содержания в них липидов. В частности, после длительной умственной работы, при утомлении количество фосфолипидов в нейронах уменьшается (очевидно, это связано с более яркой памятью у лиц, занимающихся напряженным умственным трудом). Состав мембранных липидов определяется средой обитания и характером питания. Так, увеличение растительных жиров в рационе ведет к возрастанию текучести клеточных мембран и улучшает их функции. Избыток холестерина в мембранах увеличивает их микровязкость, ухудшает транспортные функции клеточной мембраны. Недостаток жирных кислот и холестерина в пище нарушает липидный состав и функции клеточных мембран.
Молекулы белков встроены в фосфолипидный матрикс клеточной мембраны, где встречаются тысячи различных белков, которые можно объединить в основные классы: структурные белки, переносчики, ферменты, белки, образующие каналы, ионные насосы, специфические рецепторы. Один и тот же белок может быть рецептором, ферментом и насосом.
Каналы образованы белковыми молекулами, встроенными в липидный матрикс, они пронизывают мембрану. Через эти каналы могут проходить полярные молекулы. Многие мембранные белки, так же как и фосфолипиды, состоят из двух частей: заряженной и незаряженной. Незаряженные участки белков погружены в липидный слой, не несущий заряда. Заряженные участки белков взаимодействуют с заряженными участками липидов, что является важным фактором, определяющим взаиморасположение структурных элементов клеточной мембраны и ее прочность. Большинство белков, пронизывающих липидный слой, прочно связаны с фосфолипидами (интегральные белки), главной функцией которых является транспорт веществ через клеточную мембрану. Большая часть интегральных белков — гликопротеиды. Белки, прикрепленные к поверхности клеточной мембраны (в основном к внутренней ее части), называют периферическими, они, как правило, являются ферментами (ацетилхолинестераза, фосфатазы, аденилатциклаза, протеинкиназы). Некоторые интегральные белки также выполняют функцию ферментов, например АТФаза. Рецепторами и антигенами мембраны могут быть как интегральные, так и периферические белки. Белки, примыкающие к мембране с внутренней стороны, являются также составной частью цитоскелета, который обеспечивает дополнительную прочность клеточной мембране и ее эластичность.
Обновление белков мембраны происходит очень быстро — в течение 2 — 5 дней (срок их жизни).
Клеточная мембрана нейрона, как и большинства клеток организма, имеет отрицательный поверхностный заряд, который обеспечивается выступающей из мембраны клетки углеводной частью гликолипидов, фосфолипидов, гликопротеидов. Мембрана обладает текучестью, т.е. ее отдельные части могут перемещаться из одного участка на другой.
Клеточные мембраны обладают избирательной проницаемостью — одни вещества пропускают, другие не пропускают; в частности, мембрана легко проницаема для жирорастворимых веществ, проникающих через липидный слой; большинство мембран пропускают воду. Анионы органических кислот не проходят через мембрану, но имеются каналы, избирательно пропускающие ионы К+, Na+, Ca2+, СГ. При действии нервных импульсов проницаемость мембраны нейрона для различных ионов изменяется, это обеспечивает движение ионов согласно концентрационному и электрическому градиентам, что выражается в возникновении возбуждающих и тормозных потенциалов.
Механизмы транспорта веществ через клеточную мембрану нейрона
Транспорт частиц через клеточную мембрану нейрона обеспечивает: 1) поступление в клетку различных веществ, необходимых для синтеза клеточных структур и выработки энергии; 2) выделение клетками продуктов ее обмена и биологически активных веществ — нейрогормонов, нейромедиаторов; 3) создание электрических зарядов клеток, возникновение и распространение возбуждения.
Транспорт веществ через клеточную мембрану необоснованно делят на пассивный (без затрат энергии) и активный (с затратой энергии). Считают, что движущей силой пассивного перемещения веществ является концентрационный (химический) и электрический градиенты. Согласно концентрационному градиенту частицы перемещаются из области с высокой концентрацией в область с низкой концентрацией. Согласно электрическому градиенту положительно заряженные частицы стремятся перейти в область с отрицательным электрическим зарядом, отрицательно заряженные частицы — в противоположном направлении. При этом направления электрического и концентрационного градиентов могут совпадать и не совпадать.
Следует, однако, заметить, что термин «пассивный транспорт» не соответствует реальной действительности, так как электрический и концентрационный градиенты в живой клетке создаются активно, т.е. с затратой энергии.
Только обмен веществ между организмом и внешней средой может проходить частично без затрат энергии, если имеется концентрационный градиент — это диффузия газов из легких в кровь или выход их из крови, всасывание питательных веществ в кровь из желудочно-кишечного тракта, если их концентрация в кишечнике больше, чем в крови. Поэтому термин «пассивный транспорт» необходимо исключить, так как подобного механизма в животном организме вообще не существует: все виды транспорта веществ в организме осуществляются активно, с затратой энергии. Но в одних случаях энергия затрачивается непосредственно на транспорт какой-то частицы, например иона Na+, с помощью белковой молекулы, называемой насосом. Это первично активный механизм, в данном случае создается концентрационный (химический) градиент — потенциальный запас энергии. В других случаях энергия на перенос частиц затрачивается опосредованно, например перенос молекул глюкозы с помощью натрия, т.е. это вторично-активный механизм, энергия расходуется только на перенос натрия. Считают, что движение воды согласно закону осмоса осуществляется пассивно, без затрат энергии: вода движется в область с высокой концентрацией частиц (с высокой осмолярностью). Однако при одинаковом осмотическом давлении по обе стороны мембраны одностороннее движение воды прекращается. Движение воды, в результате которого была израсходована потенциальная энергия в виде концентрационного градиента, нельзя назвать пассивным, без затрат энергии, это вторично-активный транспорт.
Самостоятельно в организме могут передвигаться лишь некоторые клетки, например лейкоциты, тучные клетки. В частности, амебоидная подвижность нейтрофилов обусловлена образованием двигательных псевдоподий, при этом энергия расходуется на деятельность сократительного аппарата — акто-миозиновых структур. Однако все частицы, в том числе и ионы, не могут перемещаться сами вообще, у них нет собственного механизма передвижения (транспортного средства). Транспортируемые частицы являются пассивным элементом во всех случаях без исключения, их движение обеспечивает какой-то механизм, находящийся вне их (внешняя относительно частицы сила), например концентрационный градиент, ионная помпа, передвигающая ион. Таким образом, расход энергии в организме на транспорт веществ в одних случаях осуществляется непосредственно, в других — опосредованно.
Если энергия расходуется непосредственно на перенос частиц, транспорт следует называть первично-активным. При расходовании Ранее запасенной энергии на транспорт частиц, например концентрационного градиента, такой транспорт называют вторично-активным. Поскольку транспорт веществ в обоих случаях является активным (с затратой энергии), целесообразно использовать термины первичный и вторичный транспорт веществ.
Первичный транспорт
Первичный транспорт — это такой транспорт, при котором энергия расходуется непосредственно на перенос частиц. Он включает, во-первых, перенос отдельных ионов вопреки концентрационному и электрическому градиентам с помощью специальных ионных насосов, во-вторых, эндоцитоз, экзоцитоз и трансцитоз (перенос через клетку, который для нейрона не характерен).
Транспорт веществ с помощью насосов (помп). Насосы представляют собой белковые молекулы, обладающие свойствами переносчика и АТФазной активностью. Непосредственным источником энергии являются АТФ. Обычно указывают на существование трех ионных насосов: натрий-калиевого, кальциевого и водородного (Na/K-, Ca-, и Н-насосы). Есть основание предполагать наличие и хлорного С1-насоса, о чем свидетельствуют определенные факты. Насосы локализуются на клеточных мембранах или мембранах органелл клеток.
Вторичный транспорт
Вторичный транспорт — это переход различных частиц и молекул воды за счет ранее запасенной (потенциальной) энергии. Потенциальная энергия создается в виде электрического и концентрационного градиентов, гидростатического давления, что обеспечивает транспорт веществ через клеточную мембрану нейронов и кровеносных сосудов. К вторичному транспорту относятся следующие виды.
Диффузия. Согласно законам диффузии частицы перемещаются из области с высокой концентрацией в область с низкой концентрацией. Частицы с одноименными электрическими зарядами отталкиваются, с разноименными зарядами — притягиваются друг к другу. Направление диффузии определяется взаимодействием электрического и концентрационного (химического) градиентов. Если частицы не заряжены, то направление их диффузии определяется только градиентом концентрации. Скорость диффузии определяется проницаемостью клеточной мембраны, а также градиентом концентрации для незаряженных частиц; электрическим и концентрационным градиентами для заряженных частиц. Направления действия электрического и концентрационного градиентов могут не совпадать. Например, Na+ в процессе возникновения возбуждения продолжает поступать в клетку, когда она внутри уже заряжена положительно. Этот переход ионов обеспечивается концентрационным градиентом вопреки электрическому градиенту. Совокупность химического (концентрационного) и электрического градиентов называют электрохимическим градиентом. Различают следующие виды диффузии.
Простая диффузия осуществляется либо непосредственно через липидный бислой, либо через каналы. При этом заряженные частицы движутся согласно электрохимическому градиенту, а незаряженные — согласно химическому градиенту.
Через липидный бислой проходят жирорастворимые частицы. Если они находятся в воде по одну сторону мембраны, то могут внедряться в липидную оболочку благодаря тепловому движению (при этом необходимо освободиться от гидратной оболочки). Частицы-неэлектролиты обычно легко освобождаются от гидратной оболочки (разрыв водородных связей). Естественно, с уменьшением молекулярной массы способность перехода частиц через мембрану возрастает. Примером простой диффузии через липидный слой может служить диффузия малых незаряженных полярных молекул: алкоголя, кислорода, углекислого газа, стероидных гормонов и других липидов, тироксина, мочевины, а также чуждых клетке веществ, в частности ядов и лекарств. Этот процесс происходит слишком медленно и плохо контролируется.
Входе эволюции сформировались специальные каналы, по которым могут проходить различные частицы, причем ионы очень быстро (за 10~7— 1(Г8 с). Каналы заполнены водой и кроме ионов через них могут проходить малые молекулы неэлектролитов (этанол, мочевина), заряженные молекулы. Диаметр этих каналов 0,3 — 0,8 нм. Скорость диффузии определяется электрохимическим градиентом и проницаемостью клеточной мембраны для данного вещества. С течением времени скорость простой диффузии изменяется мало, пока существует движущая сила (электрический или концентрационный градиенты), так как по одному и тому же каналу или через липидный бислой после прохождения одной частицы сразу же может следовать другая.
Облегченная диффузия осуществляется также согласно концентрационному градиенту, но обеспечивает перенос веществ, способных образовывать комплексы с молекулами-переносчиками. Переносчик должен свободно переходить с одной стороны мембраны на другую. Этот транспорт осуществляется очень быстро, поскольку переносчик облегчает переход транспортируемого вещества через мембрану. Движущей силой является градиент транспортируемого вещества. С помощью простой диффузии через мембрану не могут проходить даже такие небольшие полярные молекулы, как моносахариды, аминокислоты.
Облегченная диффузия имеет ряд особенностей по сравнению с простой диффузией: а) наличие специфических переносчиков для отдельных или нескольких веществ, близких по строению; вещества, имеющие сходные по строению молекулы, могут переноситься одним и тем же переносчиком и конкурировать за переносчик; б) у молекулы-переносчика может быть особый канал, пропускающий вещество только одного определенного типа; в) с увеличением концентрации вещества с одной стороны мемб- > раны скорость облегченной диффузии возрастает только до определенного предела в отличие от простой диффузии.
Прекращение нарастания облегченной диффузии при увеличении концентрации вещества свидетельствует о том, что все переносчики уже заняты (явление насыщения). Имеются специфическое стимулирование и ингибирование облегченной диффузии: например, флоридзин, введенный в просвет кишечника, специфически подавляет транспорт Сахаров, не затрагивая переноса аминокислот; инсулин активирует перенос глюкозы, аминокислот в клетки организма. Переносчиками являются белковые молекулы мембраны, которые совершают челночные движения с одной стороны мембраны на другую либо встраиваются в мембрану. В последнем случае образуется канал, по которому проходят транспортируемые вещества, в основном сахара, аминокислоты.
В случае предполагаемых челночных движений белковых молекул-переносчиков возникает вопрос: какая сила обеспечивает транспорт самих переносчиков? Если это одностороннее движение, то оно быстро прекратится после уравнивания концентрации самих переносчиков по обе стороны клеточной мембраны. На этот вопрос ответа пока нет. По-видимому, возможны два механизма. Во-первых, за счет создания градиента концентрации самого переносчика, с помощью концентрационного градиента транспортируемого вещества. Если, например, концентрация глюкозы или аминокислоты больше вне клетки, нежели в клетке, то они могут переходить в клетку согласно своему градиенту концентрации. Образование комплекса молекул глюкоза-переносчик лишь улучшает прохождение глюкозы через мембрану согласно концентрационному градиенту глюкозы. Движущей силой является концентрационный градиент глюкозы. На другой стороне мембраны комплекс распадается, поэтому концентрация молекул-переносчиков возрастает, и они в соответствии со своим концентрационным градиентом переходят с внутренней на внешнюю сторону мембраны, снова соединяются с глюкозой и ускоряют ее переход в клетку. Во-вторых, челночные движения переносчика могут осуществляться с помощью ионов К+. Известно, что К+ постоянно диффундирует из клетки согласно концентрационному градиенту. При этом на внутренней стороне клеточной мембраны может образоваться комплекс ион К+ — молекула переносчика, который и перейдет на внешнюю сторону мембраны. В этом случае движущей силой является концентрационный градиент К+, который затем переносится в клетку Na/K-помпой с непосредственной затратой энергии, т. е. первично-активно. Напомним, что энергия здесь затрачивается только на транспорт Na+, т.е. транспорт веществ экономичен. Переносчик же транспортируется вторично-активно, если не будет работать Na/K-помпа, челночные движения переносчика согласно такому представлению прекратятся.
Осмос — это частный случай диффузии: движение воды (растворителя) через полупроницаемую мембрану в область с большей концентрацией частиц, т.е. с большим осмотическим давлением. Осмотическое давление — это диффузионное давление, обеспечивающее движение растворителя через полупроницаемую мембрану. Измеряется минимальной величиной гидростатического Давления, препятствующего движению растворителя через полупроницаемую мембрану. Осмотическое давление одномолярного Раствора чрезвычайно велико: 22,4 атм, в плазме крови оно существенно ниже — 7,6 атм, несколько больше внутри клетки, что и обеспечивает ее упругость вследствие поступления воды в клетку и растяжения ее мембраны. Осмос продолжается до выравнивания осмотического давления по обе стороны полупроницаемой мембраны или выравнивания осмотического давления и гидростатического противодавления. Поэтому при подавлении метаболизма клетки быстро набухают, так как внутри клетки осмотическое давление сохраняется повышенным: внутрь клеток поступает вода и они становятся более упругими. Вода поступает в клетку через водные каналы и временные поры, образующиеся между молекулами липидов и при смещении белков. Через водные каналы могут проходить также малые незаряженные молекулы: кислород, углекислый газ, этанол, мочевина.
Натриевый механизм: энергия затрачивается на создание градиента натрия, здесь различают два варианта данного механизма транспорта.
При первом варианте направление движения транспортируемого вещества совпадает с направлением движения натрия согласно его электрохимическому градиенту (симпорт). Глюкоза соединяется с белком-переносчиком, который соединяется с Na+, aNa+ согласно концентрационному и электрическому градиентам, диффундирует в клетку и несет с собой глюкозу. В клетке комплекс распадается, Na+ выводится помпой с непосредственной затратой энергии из клетки в интерстиций вопреки электрохимическому градиенту (первично-активно). С помощью натриевого механизма обеспечивается обратный захват (реабсорбция) медиатора в пресинаптическую терминаль из синаптической щели в синапсах ЦНС. Транспорт веществ с помощью Na+ осуществляется согласно законам диффузии. Транспортируемое вещество при этом может поступать в клетку вопреки собственному концентрационному градиенту. Движущей силой является электрохимический градиент Na+. Глюкоза вместе с Na+ идет в клетку даже в случае ее большей концентрации в клетке, нежели в среде, если, конечно, электрохимический градиент Na+ превосходит концентрационный градиент глюкозы.
При втором варианте натриевого механизма перемещение транспортируемых частиц направлено в противоположную сторону движения Na+ (антипорт, т.е. противотранспорт). С помощью этого обменного механизма регулируется, например, содержание Са2+ в клетке, рН внутри клетки за счет выведения Н-иона в обмен на внеклеточный Na+. Внутриклеточная концентрация Са2+ на несколько порядков ниже внеклеточной. Натриевый концентрационный градиент участвует в выведении Са2+ из клетки. Об этом свидетельствует, в частности, следующий факт. Выведение Са2+ из клетки снижается, если удалить из внеклеточной среды Na+. Это позволяет предположить, что Са2+ выводится из клетки в обмен на поступающий в нее Na+ и противоположно направленные потоки этих ионов сопряжены друг с другом; обеспечивается он переносчиком-обменником. Исходным источником энергии этого процесса опять является градиент Na+, который в конечном счете формируется за счет АТФ-зависимого активного транспорта Na+. Поэтому при ингибировании Na/K-АТФазы, при уменьшении внеклеточной концентрации Na+ и в бескалиевой среде (когда Na+ выводится недостаточно из клетки) Na/Ca-об-менник блокируется, в результате чего увеличивается внутриклеточная концентрация Са2+.
Однако конкретный механизм работы переносчика-обменника неясен. Переносчик может транспортировать Са2+ и Н+ вопреки их электрическим и концентрационным градиентам только в том случае, если сам переносчик имеет собственный градиент: его концентрация на внешней стороне мембраны клетки больше, чем на внутренней. Причем этот градиент должен постоянно поддерживаться, иначе перенос Са2+ и Н+ прекратится. По-видимому, выведение Са2+ и Н+ из клетки в результате диффузии Na+ в клетку (антипорт—противотранспорт) осуществляется следующим образом. Na+ постоянно диффундирует в клетку согласно своему электрохимическому градиенту и транспортирует с собой (в комплексе) молекулы-переносчики, что и ведет к созданию концентрационных градиентов молекул-переносчиков, направленных из клетки. Са2+ и Н+на внутренней стороне мембраны клетки соединяются со своими переносчиками и транспортируются из клетки в виде комплексов согласно градиентам своих переносчиков. Именно поэтому, например, блокада Na/K-насоса ведет к накоплению Са2+ в клетках (транспорт Са2+ из клетки уменьшается). Это примеры вторичного транспорта вещества за счет первичного транспорта Na+, который с помощью помпы выводится из клетки. Переносчики же совершают челночные движения за счет работы Na/K-насоса (вторично-активно) и транспортируют с собой Са2+ и Н+.
Транспорт веществ из кровеносных сосудов в интерстиций ЦНСосуществляется с помощью диффузии, осмоса и фильтрации, т.е. перехода раствора через полупроницаемую мембрану (стенку сосуда) под действием градиента гидростатического давления между жидкостями по обе стороны этой мембраны. Градиент гидростатического давления создается либо деятельностью сердца (фильтрация в артериальном конце капилляра всех органов и тканей организма, а также образование первичной мочи в почке), либо гладкой мускулатурой желудочно-кишечного тракта и мышечного пресса, обеспечивающих повышение гидростатического давления в полости желудка и кишечника, что способствует всасыванию веществ в кровь.
Таким образом, механизмы вторичного транспорта веществ весьма разнообразны. Что касается вторичного транспорта ионов, то он осуществляется, как правило, с помощью простой диффузии через специальные ионные каналы.
Ионные каналы
Ионные каналы образованы белками, они весьма разнообразны по устройству и механизму действия.
Классификация ионных каналов проводится по нескольким признакам.
1. По возможности управления их функцией различают управляемые и неуправляемые каналы (каналы утечки ионов). Через неуправляемые каналы ионы перемещаются постоянно, но медленно, естественно, при наличии электрохимического градиента, как и в случае быстрого перемещения ионов по управляемым каналам, которые могут быть быстрыми и медленными. Потенциал действия в нейроне возникает в основном вследствие активации быстрых Na- и К-каналов. Управляемые каналы имеют ворота с механизмами их управления, поэтому ионы могут проходить только при открытых воротах.
2. В зависимости от стимула, активирующего или инактивирующего управляемые ионные каналы, основными каналами нейронов ЦНС являются потенциалчувствительные и хемочувствитель-ные каналы. При взаимодействии медиатора (лиганда) с рецепторами хемочувствительного канала, расположенного на поверхности клеточной мембраны, может происходить открытие его ворот, поэтому хемочувствительный канал называют также рецеп-торуправляемым каналом. Лиганд — это биологически активное вещество или фармакологический препарат, активирующий или блокирующий рецептор. Открытие ворот хемочувствительных каналов происходит в результате конформационных изменений рецепторного комплекса. Ворота потенциалзависимых каналов открываются и закрываются при изменении величины мембранного потенциала. Поэтому в конструкции их воротного механизма должны быть частицы, несущие электрический заряд.
3. В зависимости от селективности различают ионоселективные каналы, пропускающие только один ион, и каналы, не обладающие селективностью. В нейронах имеются Na-, K-, Са- и С1-селективные каналы. Есть каналы, пропускающие несколько ионов, например Na+, K+ и Са2+, т.е. не обладающие селективностью. Наиболее высока степень селективности потенциалчувствительных (потенциалзависимых) каналов, несколько ниже она у хемочувствительных (рецепторзависимых) каналов постсинаптических мембран, через каналы которых могут одновременно проходить ионы Na+ и К+.
4. Для одного и того же иона может существовать несколько видов каналов. Наиболее важными из них для формирования биопотенциалов являются следующие.
Каналы для К+. Калиевые неуправляемые каналы покоя (каналы утечки), через которые постоянно выходит К+ из клетки, что является главным фактором в формировании мембранного потенциала (потенциала покоя). Потенциалчувствительные управляемые ^-каналы сравнительно медленно активируются при возбуждении клетки в фазу деполяризации с последующим увеличением активации, что обеспечивает быстрый выход К+ из клетки и реполяризацию ее (генерация потенциала действия).
Каналы для Na+ — медленные (утечки) и быстрые: 1) быстрые а-каналы потенциалчувствительны, быстро активирующиеся при уменьшении мембранного потенциала, что обеспечивает вход Na+ в клетку во время ее возбуждения (восходящая часть потенциала действия). Затем эти каналы быстро инактивируются; 2) медленные неуправляемые Na-каналы — каналы утечки, через которые Na+ постоянно диффундирует в клетку и переносит с собой другие молекулы, например глюкозу, аминокислоты, молекулы-переносчики. Таким образом, Na-каналы утечки обеспечивают вторичный транспорт веществ и участие Na+ в формировании мембранного потенциала.
Устройство ионных каналов и их функционирование. Каналы имеют устье и селективный фильтр, а управляемые каналы — и воротный механизм, каналы заполнены жидкостью, их размеры 0,3 — 0,8 нм. Селективность ионных каналов определяется их размером и наличием в канале заряженных частиц. Эти частицы имеют заряд, противоположный заряду иона, который они притягивают, что обеспечивает проход иона через данный канал (одноименные заряды, как известно, отталкиваются). Через ионные каналы могут проходить и незаряженные частицы. Ионы, проходя через канал, должны избавиться от гидратной оболочки, иначе их размеры будут больше размеров канала. Диаметр иона Na+, например, с гидратной оболочкой равен 0,3 нм, а без гидратной оболочки — 0,19 нм. Слишком мелкий ион, проходя через селективный фильтр, не может отдать гидратную оболочку, поэтому он не может пройти через канал. Однако, по-видимому, имеются и другие механизмы селективности клеточной мембраны. Гипотеза «просеивания» не дает ответ, например, на вопрос: почему К+ не проходит через открытые Na-каналы в начале цикла возбуждения клетки? Но тем не менее она дает удовлетворительное, а в некоторых случаях и абсолютно убедительное объяснение избирательной (селективной) проницаемости клеточных мембран для разных частиц и ионов.
Особенности функционирования различных видов управляемых каналов. Во-первых, они отличаются по степени селективности. Наиболее высока степень селективности потенциалчувствительных (потенциалзависимых) каналов. Во-вторых, у каналов разных видов может наблюдаться или отсутствовать взаимодействие между собой. Так, частичная деполяризация клеточной мембраны за счет активации хемочувствительных каналов может привести к активации потенциалчувствительных каналов, например для ионов, что обеспечивает возбуждение нейрона. Активация же потенциалчувствительных каналов не влияет на функцию хемочувствительных каналов нейронов.
Ионные каналы блокируются специфическими веществами и фармакологическими препаратами. Новокаин, например, как местный анестетик, снимает болевые ощущения, потому что он, блокируя Na-каналы, прекращает проведение возбуждения по нервным волокнам.
Открытие «животного электричества» и его сущность
Наблюдение биоэлектрических явлений. В конце XVIII в. (1786) профессор анатомии Болонского университета Луиджи Гальвани провел ряд опытов, положивших начало целенаправленным исследованиям биоэлектрических явлений. В первом опыте, подвешивая с помощью медного крючка на железной решетке препарат задних лапок лягушек со снятой кожей, ученый обнаружил, что всякий раз, когда мышцы касались решетки, они отчетливо сокращались. Л. Гальвани высказал предположение о том, что сокращение мышц является следствием воздействия на них электричества, источником которого выступают «животные ткани» — мышцы и нервы.
Однако другой итальянский исследователь — физик и физиолог Вольта — оспорил это заключение. По его мнению, причиной сокращения мышц был электрический ток, возникающий в области контакта двух разнородных металлов: меди и железа (гальваническая пара) — с тканями лягушки. С целью проверки своей гипотезы Л. Гальвани поставил второй опыт, в котором нерв нервно-мышечного препарата набрасывался на мышцу стеклянным крючком так, чтобы он касался поврежденного и неповрежденного ее участков. В этом случае мышца также сокращалась. Во ВТОРОМ опыте были получены абсолютные доказательства существования «животного электричества».
Регистрация биоэлектрических явлений впервые была осуществлена Маттеучи в 1838 г. с помощью гальванометра, одна из клемм которого присоединялась к поврежденному участку мышцы, другая — к неповрежденному. При этом стрелка гальванометра отклонялась (ток покоя). Размыкание цепи гальванометра сопровождалось возвращением стрелки гальванометра в прежнее (нулевое) положение. Маттеучи впервые показал, что наружная поверхность мышцы заряжена электроположительно по отношению к ее внутреннему содержимому и эта разность потенциалов, свойственная состоянию покоя (ток покоя), резко падает при возбуждении (однофазный ток действия). Если оба электрода гальванометра приложить к неповрежденной мышце на некотором расстоянии друг от друга и нанести раздражение на один конец мышцы, то стрелка гальванометра сначала отклоняется в одну сторону, затем — в другую (регистрируется двухфазный ток действия). Маттеучи произвел также опыт, известный под названием опыта вторичного сокращения: при накладывании на сокращающуюся мышцу нерва второго нервно-мышечного препарата его мышца тоже начинает сокращаться. Результат опыта Маттеучи объясняется тем, что возникающий в мышце при ее возбуждении потенциал действия оказывается достаточно сильным, чтобы вызвать возбуждение другого нерва и мышцы. В настоящее время существует много различных вариантов регистрации биоэлектрических явлений, но их можно объединить в две основные группы: по местоположению электродов (внутриклеточное и внеклеточное отведения) и по числу отводящих электродов (монополярное, биполярное, мультиполярное отведения). Электроды могут быть металлическими и стеклянными. В случае монополярного отведения, один электрод активный, второй — индифферентный, его площадь в десятки раз больше активного электрода. При внутриклеточном отведении применяется стеклянный микроэлектрод, который представляет собой микропипетку с диаметром кончика 0,5 — 1 мкм. Микроэлектрод заполняется ЗМ КС1. В широкую часть микроэлектрода вставляется серебряная проволочка, соединяемая с регистрирующим устройством. Индифферентным внеклеточным электродом является хлорированная серебряная пластинка. При внутриклеточном отведении клетка способна функционировать в течение нескольких часов. Микроэлектродный способ регистрации биопотенциалов позволил изучить механизмы создания клеткой электрических зарядов, возникновения возбуждения в живых клетках. Однако еще в конце XIX в., задолго до появления микроэлектродной техники, стало ясно, что «животное электричество» обусловлено процессами, происходящими на клеточной мембране (Герман, Дюбуа-Реймон, Бернштейн). В настоящее время достаточно хорошо изучены механизмы формирования мембранного потенциала покоя и мембранного потенциала действия, т.е. процессы возбуждения клетки.
Сущность процесса возбуждения заключается в следующем. Все клетки организма имеют электрический заряд, обеспечиваемый неодинаковой концентрацией анионов и катионов внутри и вне клетки. Различная концентрация анионов и катионов внутри и вне клетки является следствием работы ионных насосов и неодинаковой проницаемости клеточной мембраны для разных ионов. При действии раздражителя на клетку возбудимой ткани изменяется проницаемость ее мембраны (обычно сначала повышается для Na+ и быстро возвращается к норме, затем также, но более медленно изменяется для К+), вследствие чего ионы быстро перемещаются в клетку и из клетки согласно электрохимическому градиенту (совокупность концентрационного и электрического градиентов). Таким образом, эта ответная реакция возбудимой клетки на раздражение, выражающаяся в быстром перемещении ионов в клетку и из клетки согласно электрохимическому градиенту, и есть возбуждение, основой которого является потенциал покоя.
Потенциал покоя (ПП)
Общая характеристика и непосредственная причина формирования ПП
Потенциал покоя — это разность между электрическими потенциалами внутри и вне клетки в состоянии покоя. Его величина обычно варьирует в пределах 30 — 90 мВ (в волокнах скелетной мышцы — 60 — 90 мВ, в нервных клетках — 50 — 80 мВ, в гладких мышцах — 30 — 70 мВ, в сердечной мышце — 80 — 90 мВ). При регистрации ПП луч осциллографа во время прокола мембраны клетки микроэлектродом скачком отклоняется и показывает отрицательный заряд внутри клетки.
ПП играет исключительно важную роль в жизнедеятельности самой клетки и организма в целом. В частности, он составляет основу возбуждения и переработки информации нервной клеткой, обеспечивает регуляцию деятельности внутренних органов и опорно-двигательного аппарата посредством запуска процессов возбуждения и сокращения в мышце. Нарушение процессов воз-оуждения в кардиомиоцитах ведет к остановке сердца.
Внутри- и внеклеточные концентрации ионов (ммоль-л"1) в мышечных клетках гомойотермных животных
Согласно мембранно-ионной теории (Бернштейн, Ходжкин, Хаксли, Катц) непосредственной причиной формирования ПП является неодинаковая концентрация анионов и катионов внутри и вне клетки.
В нервных и мышечных клетках концентрация К+ внутри клетки в 30 —40 раз больше, чем вне клетки; концентрация Na+ вне клетки в 10 — 12 раз больше, нежели в клетке. Ионов СГ вне клетки в 15 — 20 раз больше, чем внутри клетки. В клетке имеется небольшое количество ионов Mg2+. Кальций в свободном состоянии находится в основном вне клетки, он содержится также в эндоплазматичес-ком ретикулуме, в гиалоплазме его очень мало, что обусловливается отчасти активным транспортом Са2+ наружу через клеточную мембрану, отчасти поглощением его эндоплазматическим ретику-лумом (резервуар для Са2+) и другими органеллами, например митохондриями, связыванием Са2+ цитратом, глютаматом.
В клетке находятся также крупномолекулярные анионы, главным образом это отрицательно заряженные белковые молекулы, например глютамат, аспартат, а также органические фосфаты. Различные ионы распределены неравномерно по обе стороны клеточной мембраны, во-первых, вследствие неодинаковой проницаемости клеточной мембраны для различных ионов, во-вторых, в результате работы ионных насосов, транспортирующих ионы в клетку и из клетки вопреки концентрационному и электрическому градиентам.
Потенциал действия (ПД)
Общая характеристика, механизм возникновения ПД
Потенциал действия — это электрофизиологический процесс, выражающийся в быстром колебании мембранного потенциала покоя вследствие перемещения ионов в клетку и из клетки и способный распространяться без декремента (без затухания). ПД обеспечивает передачу сигналов между нервными клетками, между нервными центрами и рабочими органами, в мышцах ПД обеспечивает процесс электромеханического сопряжения. Характеристика ПД. Величина ПД колеблется в пределах 80 — 130 мВ, длительность пика ПД нервного волокна 0,5 — 1 мс, волокна скелетной мышцы — до 10 мс с уютом замедления деполяризации в ее конце. Длительность ПД сердечной мышцы 300 — 400 мс. Амплитуда ПД не зависит от силы раздражения, она всегда максимальна для данной клетки в конкретных условиях: ПД подчиняется закону «все или ничего», но не подчиняется закону силовых отношений, т. е. закону силы. При малом раздражении клетки ПД либо совсем не возникает, либо достигает максимальной величины, если раздражение является пороговым или сверхпороговым. Следует отметить, что слабое (подпороговое) раздражение может вызвать локальный потенциал. Он подчиняется закону силы: с увеличением силы стимула величина его также возрастает. В составе ПД различают три фазы: 1 — деполяризация, т.е. исчезновение заряда клетки (уменьшение мембранного потенциала до нуля); 2 — инверсия, т.е. изменение заряда клетки на обратный, когда внутренняя сторона мембраны клетки заряжается положительно, а внешняя — отрицательно (от лат. inversio— переворачивание); 3 — реполяризация, т.е. восстановление исходного заряда клетки, когда внутри клетки заряд снова становится отрицательным, а снаружи — положительным.
Механизм возникновения ПД. Если действие раздражителя на клеточную мембрану приводит к началу развития ПД, далее сам все время будет возникать. Но после исчезновения градиентов концентраций ионов (устранения потенциальной энергии) клетка генерировать ПД не будет. Рассмотрим фазы ПД.
Существует много различных названий фаз ПД (единого мнения не сложилось): 1) местное возбуждение — пик ПД — следовые потенциалы; 2) фаза нарастания — фаза спада — следовые потенциалы; 3) деполяризация — овершут (перехлест, превышение, перелет), причем эта фаза, в свою очередь, делится на восходящую (инверсия, от лат. inversio — переворачивание) и нисходящую (реверсия, от лат. reversio — возврат) реполяризацию. Но и здесь очевидны некоторые противоречия. Например, деполяризацией называют всю восходящую часть ПД, однако она включает не только процесс деполяризации, но и реполяризации с обратным знаком (овершут). Имеются и другие названия. Наиболее корректны названия фаз ПД, в которых заложена общая идея, например изменение заряда клетки: 1) фаза деполяризации — процесс исчезновения заряда клетки до нуля; 2) фаза инверсии — изменение заряда клетки на противоположный, т.е. весь период ПД, когда внутри клетки заряд положительный, а снаружи отрицательный; 3) фаза реполяризации — восстановление заряда клетки до исходной величины (возврат к потенциалу покоя).
Фаза деполяризации. При действии деполяризующего раздражителя на клетку, например, электрического тока, начальная частичная деполяризация клеточной мембраны происходит без изменения ее проницаемости для ионов. Когда деполяризация достигает примерно 50% пороговой величины (50% порогового потенциала), возрастает проницаемость мембраны клетки для Na+, причем в первый момент сравнительно медленно. Естественно, что скорость входа Na+ в клетку при этом невелика. В этот период, как и во время всей первой фазы (деполяризации), движущей силой, обеспечивающей вход Na+ в клетку, являются концентрационный и электрический градиенты. Напомним, что клетка внутри заряжена отрицательно (разноименные заряды притягиваются друг к другу), а концентрация Na+ вне клетки в 10 — 12 раз больше, чем внутри клетки. Условием, обеспечивающим вход Na+ в клетку, является увеличение проницаемости клеточной мембраны, которая определяется состоянием воротного механизма Na-каналов (в некоторых клетках, в частности в кардиомио-цитах, в волокнах гладкой мышцы, важную роль в возникновении ПД играют управляемые каналы для Са2+). Длительность пребывания электроуправляемого канала в открытом состоянии зависит от величины мембранного потенциала. Суммарный ток ионов в любой момент определяется числом открытых каналов клеточной мембраны. Часть ионного канала, обращенная во внеклеточное пространство, отличается от части канала, обращенной внутрь клеточной среды (П. Г. Костюк). Воротный механизм Na-каналов расположен на внешней и внутренней сторонах клеточной мемб-паны, воротный механизм К-каналов — на внутренней (К+ движется из клетки наружу). В каналах для Na+ имеются активационные m-ворота, которые расположены с внешней стороны клеточной мембраны (Na+ движется внутрь клетки во время ее возбуждения), и инактивационные /г-ворота, расположенные с внутренней стороны клеточной мембраны. В условиях покоя активацион-ные w-ворота закрыты, инактивационные /г-ворота преимущественно (около 80%) открыты; закрыты также калиевые активационные ворота, инактиваци-онных ворот для К+ нет.
Некоторые авторы w-ворота называют быстрыми, /г-ворота медленными, поскольку они в процессе возбуждения клетки реагируют позже, нежели m-ворота. Однако более поздняя реакция /г-ворот связана с изменением заряда клетки, как и m-ворот, которые открываются в процессе деполяризации клеточной мембраны. Закрываются /г-ворота в фазу инверсии, когда заряд внутри клетки становится положительным, что и является причиной их закрытия. При этом нарастание пика ПД прекращается. Поэтому m-ворота лучше назвать ранними, а А-ворота — поздними.
Когда деполяризация клетки достигает критической величины (Екр, критический уровень деполяризации — КУД), которая обычно составляет -50 мВ (возможны и другие величины), проницаемость мембраны для Na+ резко возрастает: открывается большое число потенциалзависимых /я-ворот Na-каналов и Na+ лавиной устремляется в клетку. Через один открытый Na-канал за 1 мс проходит до 6000 ионов. В результате интенсивного тока Na+ внутрь клетки процесс деполяризации проходит очень быстро. Развивающаяся деполяризация клеточной мембраны вызывает дополнительное увеличение ее проницаемости и, естественно, проводимости Na+: открываются все новые и новые активационные w-ворота Na-каналов, что придает току Na+ в клетку характер регенеративного процесса. В итоге ПП исчезает, становится равным нулю. Фаза деполяризации на этом заканчивается.
Фаза инверсии. После исчезновения ПП вход Na+ в клетку продолжается (т-ворота Na-каналов еще открыты), поэтому число положительных ионов в клетке превосходит число отрицательных ионов, заряд внутри клетки становится положительным, снаружи — отрицательным. Процесс перезарядки мембраны представляет собой вторую фазу потенциала действия — фазу инверсии. Теперь электрический градиент препятствует входу Na+ внутрь клетки (положительные заряды отталкиваются ДРУГ от друга), Na-проводимость снижается. Тем не менее некото-Р°е время (доли миллисекунды) Na+ продолжает входить в клет-КУ. о чем свидетельствует продолжающееся нарастание ПД. Это означает, что концентрационный градиент, обеспечивающий движение Na+ в клетку, сильнее электрического, препятствующего входу Na+ в клетку. Во время деполяризации мембраны увеличивается проницаемость ее и для Са2+, который также идет в клетку, но в нервных волокнах, нейронах и клетках скелетной мускулатуры роль Са2+ в развитии ПД мала. В клетках гладкой мышцы и миокарда его роль существенна. Таким образом, вся восходящая часть пика ПД в большинстве случаев обеспечивается в основном входом Na+ в клетку.
Примерно через 0,5 — 2 мс и более после начала деполяризации (это время зависит от вида клетки) рост ПД прекращается в результате закрытия натриевых инактивационных г-ворот и открытия ворот К-каналов, т.е. вследствие увеличения проницаемости для К+ и резкого возрастания выхода его из клетки. Препятствует также росту пика ПД снижение электрического градиента Na+ (клетка внутри в этот момент заряжена положительно), а также выход К+ из клетки по каналам утечки. Поскольку К+ находится преимущественно внутри клетки, он согласно концентрационному градиенту быстро выходит из нее, вследствие чего уменьшается число положительно заряженных ионов в клетке. Заряд клетки снова начинает уменьшаться. Во время нисходящей составляющей фазы инверсии выходу К+ из клетки способствует также и электрический градиент. К+ выталкивается положительным зарядом из клетки и притягивается отрицательным зарядом снаружи клетки. Так продолжается до полного исчезновения положительного заряда внутри клетки, когда начинается следующая фаза ПД — фаза реполяризации. Калий выходит из клетки не только по управляемым каналам, ворота которых открыты, но и по неуправляемым, т.е. каналам утечки, что несколько замедляло ход восходящей части ПД и ускоряло ход нисходящей составляющей ПД.
Таким образом, изменение мембранного потенциала покоя ведет к последовательному открытию или закрытию электроуправляемых ворот ионных каналов и движению ионов согласно электрохимическому градиенту — возникновению ПД. Все фазы являются регенеративными: необходимо только достичь критического уровня деполяризации, далее ПД развивается за счет потенциальной энергии клетки в виде электрохимических градиентов, т.е. вторично-активно.
Амплитуда ПД складывается из величины ПП (потенциала покоя) и величины фазы инверсии, составляющей у разных клеток 10— 50мВ. Если мембранный ПП мал, амплитуда ПД этой клетки небольшая.
Фаза реполяризации связана с тем, что проницаемость клеточной мембраны для К+ все еще высока (активационные ворота калиевых каналов открыты), К+ продолжает быстро выходить из клетки согласно концентрационному градиенту. Поскольку клетка теперь снова внутри имеет отрицательный заряд, а снаружи — положительный, электрический градиент препятствует выходу К+ из клетки, что снижает его проводимость, хотя он продолжает выходить. Это объясняется тем, что действие концентрационного градиента выражено значительно сильнее электрического градиента. Таким образом, вся нисходящая часть пика ПД обусловлена выходом К+ из клетки. Нередко в конце ПД наблюдается замедление реполяризации, что объясняется уменьшением проницаемости клеточной мембраны для К+ и замедлением выхода его из клетки из-за закрытия ворот К-каналов. Следующая причина замедления тока К+ из клетки связана с возрастанием положительного потенциала наружной поверхности клетки и формированием противоположно направленного электрического градиента.
При наличии определенного ПП, как следует из описанных механизмов, ПД не должен возникать, если клетку перенести в солевой раствор, не содержащий Na+, что и было продемонстрировано в экспериментах. Если аксон помещать в растворы с различной концентрацией Na+, величина ПД будет уменьшаться с уменьшением концентрации Na+ в окружающей нервное волокно среде. ПД также уменьшается, если частично заблокировать Na-каналы тетродотоксином. При их полной блокаде ПД вообще не возникает. Возможность временного нарушения работы Na-каналов широко используется в клинической практике. Так, с помощью местных анестетиков расстраивается механизм управления ворот Na-каналов. Это приводит к прекращению проведения возбуждения в соответствующем участке нерва, устранению болевых ощущений, например при хирургических вмешательствах. Таким образом, главную роль в возникновении ПД играет Na+, входящий в клетку при повышении проницаемости клеточной мембраны и обеспечивающий всю восходящую часть пика ПД. При замене Na^" в среде на другой ион, например холин, ПД в нервной и мышечной клетках скелетной мускулатуры не возникает. Однако проницаемость мембраны для К+ тоже играет важную роль. Если повышение проницаемости для К+ предотвратить тетраэтиламмонием, мембрана после ее деполяризации реполяризуется гораздо медленнее, только за счет медленных неуправляемых каналов (каналов утечки ионов), через которые К+ будет выходить из клетки.
Роль Са2+ в возникновении ПД в нервных и мышечных клетках скелетной мускулатуры незначительна. Однако Са2+ играет важную РОЛЬ в возникновении ПД сердечной и гладкой мышц, в передаче импульсов от одного нейрона к другому, от нервного волокна к мышечному, в обеспечении мышечного сокращения. Снижение содержания Са2+ в крови на 50%, что иногда встречается в клинической практике, может привести к судорожным сокращениям скелетных мышц. Это объясняется значительным повышением возбудимости нервных и мышечных клеток в результате снижения ПП из-за уменьшения степени нейтрализации отрицательных фиксированных зарядов на поверхности клеточной мембраны и отрицательно заряженных карбоксильных групп интерстиция. Вследствие этого повышается реактивность нейронов, так как ПП приближается к Екр, кроме того, начинается активация Na-каналов. В ответ на поступление самой незначительной импульсации нейроны начинают генерировать ПД в большом количестве, что проявляется в судорожных сокращениях скелетной мускулатуры. При этом нейроны ЦНС и нервные волокна могут разряжаться и спонтанно.
Следовые явления в процессе возбуждения клетки. В конце ПД, например в скелетной мышце, нередко наблюдается замедление реполяризации, что называют отрицательным следовым потенциалом. Затем может быть зарегистрирована гиперполяризация клеточной мембраны, что более характерно для нервных клеток. Это явление называют положительным следовым потенциалом. Вслед за ним может возникнуть частичная деполяризация клеточной мембраны, которую также называют отрицательным следовым потенциалом, как и в случае замедления фазы реполяризации. Во-первых, необходимо отметить, что имеет место терминологическая путаница (два разных по происхождению отрицательных следовых потенциала). Во-вторых, замедление фазы реполяризации вообще не является следовым процессом — это часть фазы реполяризации, которая задерживается вследствие уменьшения проницаемости клеточной мембраны для К+ и замедления выхода его из клетки. В-третьих, термин «потенциал» применяется в других случаях: ПП, ПД, локальный потенциал, рецепторный потенциал, синапти-ческий потенциал. Вслед за ПД возникают не потенциалы, а сначала следовая гиперполяризация, затем — следовая деполяризация. Причем следовые явления возникают после полного восстановления мембранного потенциала до исходного уровня, но не как результат замедления фазы реполяризации, являющейся одной из фаз ПД. В сердечной и гладкой мышцах тоже наблюдается замедленная реполяризация, но на более высоком уровне — плато.
Следовая гиперполяризация клеточной мембраны обычно является следствием еще сохраняющейся повышенной проницаемости клеточной мембраны для К+, она характерна для нейронов. Активационные ворота К-каналов еще не полностью закрыты, поэтому К+ продолжает выходить из клетки согласно концентрационному градиенту, что и ведет к гиперполяризации клеточной мембраны. Постепенно проницаемость клеточной мембраны возвращается к исходной (натриевые и калиевые ворота возвращаются в исходное состояние), а мембранный потенциал становится таким же, каким он был до возбуждения клетки. Na/K-помпа непосредственно за фазы потенциала действия не отвечает, хотя она и продолжает работать во время развития ПД: ионы перемещаются с огромной скоростью согласно концентрационному и частично электрическому градиентам. Возможно К+-помпа способствует развитию следовой гиперполяризации. В некоторых клетках, например в тонких немиелинизированных нервных волокнах (болевых афферентах) хорошо выражена длительная следовая гиперполяризация. Она обеспечивается работой Na/K-насоса, активируемого процессом возбуждения (накопившимся в клетке Na+: на каждые 2К+, возвращаемые в клетку, выводится 3Na+ из клетки). Если блокировать выработку энергии, то эта гиперполяризация исчезает.
Следовая деполяризация также характерна для нейронов, она может быть зарегистрирована и в клетках скелетной мышцы. Механизм следовой деполяризации изучен недостаточно. Возможно, Это связано с кратковременным повышением проницаемости клеточной мембраны для Na+ и входом его в клетку согласно концентрационному и электрическому градиентам.
Исследование ионных токов. Запас ионов в клетке
ПД обусловлен циклическим процессом входа Na+ в клетку (восходящая часть пика) и последующим выходом К+ из клетки (нис-°Дящая часть ПД), что является, в свою очередь, следствием активации и инактивации Na- и К-каналов, т.е. изменением проницаемости клеточной мембраны.
Наиболее распространенным методом изучения функций ионных каналов является метод фиксации напряжения (voltage-clamp). Мембранный потенциал с помощью подачи электрического напряжения изменяют и фиксируют на определенном уровне, затем клеточную мембрану градуально деполяризуют, что ведет к открытию ионных каналов и возникновению ионного тока, который мог бы деполяризовать клетку. Однако при этом пропускается электрический ток, равный по величине, но противоположный по знаку ионному току, поэтому трансмембранная разность потенциалов не изменяется. Это дает возможность изучить величину ионного тока через мембрану. Применение различных блокаторов ионных каналов дает дополнительную возможность более глубоко изучить свойства каналов.
Количественное соотношение между ионными токами по отдельным каналам в покое клетки, во время ПД и их кинетику можно выяснить с помощью метода локальной фиксации потенциала (patchclamp). К мембране подводят микроэлектродприсоску (внутри его создается разрежение) и, если на этом участке оказывается канал, исследуют ионный ток через него. В остальном методика подобна предыдущей. И в этом случае применяют специфические блокаторы каналов. В частности, при подаче на мембрану фиксированного деполяризующего потенциала было установлено, что через Na-каналы может проходить и К , но его ток в 10 — 12 раз меньше, а через К-каналы может проходить Na , его ток в 100 раз меньше, чем К+. В гладкомышечных клетках в генезе восходящей части ПД ведущую роль играет Са2+, поступающий в клетку; в кардиомиоцитах Са2+ играет важную роль в развитии плато ПД.
Запас ионов в клетке, обеспечивающих возникновение возбуждения (ПД), огромен. Концентрационные градиенты ионов в результате одного цикла возбуждения практически не изменяются. Клетка может возбуждаться до 5-Ю5 раз без подзарядки, т.е. без работы Na/K-насоса. Число импульсов, которое генерирует и проводит нервное волокно, зависит от его толщины, что определяет запас ионов. Чем толще нервное волокно, тем больше запас ионов, тем больше импульсов оно может генерировать (от нескольких сот до нескольких сотен тысяч) без участия Na/K-насоса. Однако в тонких С-волокнах на возникновение одного ПД расходуется около 1 % концентрационных градиентов Na+ и К+. Если заблокировать выработку энергии, то клетка будет еще многократно возбуждаться и в этом случае. В реальной же действительности Na/K-насос постоянно переносит Na+ из клетки, а К+ возвращает в клетку, в результате чего постоянно поддерживается концентрационный градиент Na и К+, что осуществляется за счет непосредственного расхода энергии, источником которой является АТФ. Имеются данные, что увеличение внутриклеточной концентрации Na+ сопровождается увеличением интенсивности работы Na/K-насоса. Это может быть связано исключительно с тем, что для переносчика становится доступно большее количество внутриклеточного Na+.
Локальный потенциал. Оценка проницаемости клеточной мембраны
Локальный потенциал. При раздражении возбудимой ткани не всегда возникает ПД. В частности, если сила раздражителя мала, деполяризация не достигнет критического уровня, естественно, не возникнет импульсное, т.е. распространяющееся, возбуждение. В этом случае ответ ткани на раздражение будет иметь форму локального потенциала. Локальными потенциалами возбудимых клеток также являются: возбуждающий постсинаптический потенциал, рецепторные потенциалы, тормозной постсинаптический потенциал. Величина локальных потенциалов весьма вариабельна, она может достигать 10 — 40 мВ в зависимости от рода клеток и силы стимула. Свойства такого ответа существенно отличаются от импульсного.
Повышение возбудимости клетки во время локального потенциала объясняется тем, что клеточная мембрана оказывается частично деполяризованной. Если Екр остается на постоянном уровне, то для достижения критического уровня деполяризации во время локального потенциала нужен значительно меньшей силы раздражитель. Кроме того, при частичной деполяризации клеточной мембраны начинают активироваться Na-каналы. Амплитуда ПД не зависит от силы раздражения, потому что он возникает вследствие регенеративного процесса.
Состояние проницаемости клеточной мембраны можно определить по скорости движения ионов в клетку или из клетки согласно концентрационному градиенту, т.е. по проводимости ионов Na+ и К+ (gNa и gK), но при условии, что влияние электрического градиента на движение ионов исключено или оно постоянное. Последнее условие выполняется с помощью методики фиксации напряжения (voltage-clamp) на постоянном уровне. Ток Na+ в клетку при деполяризации быстро нарастает и начинает падать уже через 0,5 мс. Ток К+ нарастает медленно и приближается к максимальной величине к тому времени, когда ток Na+ возвращается к нулю. Причем выход К+ из клетки при всех уровнях деполяризации возникает с задержкой, возрастает с увеличением деполяризации мембраны, достигает максимума примерно через 1,5 мс, после чего начинает падать и к 3 мс приближается к исходному уровню.
На пике потенциала действия gNa начинает падать, в то время как gK продолжает медленно увеличиваться, обусловливая фазу реполяризации. В обычных условиях мембранные токи при данных концентрационных градиентах зависят не только от проницаемости клеточной мембраны, но и от мембранного потенциала, точнее — от электрического градиента. Ионные токи могут точно характеризовать изменения gNa и gK только при постоянном мембранном потенциале. В состоянии покоя соотношение констант проводимости ионов K+:Na+:Cl~ равно 1:0,04:0,45, а во время фазы деполяризации ПД: 1:20:0,45, из чего следует, что проницаемость мембраны для К+ и СГ во время фазы деполяризации и восходящей фазы инверсии не изменяется. Это хорошо согласуется с общепринятыми представлениями о механизме возникновения ПД: Na+ движется в этот период внутрь клетки; затем проницаемость клеточной мембраны повышается для К+, что и определяет причину реполяризации — выход К+ из клетки. Проницаемость клеточной мембраны для ионов СГ во время развития потенциала действия не изменяется. Естественно, ион СГ в возникновении ПД участия не принимает.
Изменения возбудимости клетки во время ее возбуждения. Лабильность
Возбудимость клетки во время ее возбуждения быстро и сильно изменяется. Различают несколько фаз изменения возбудимости, каждая из которых строго соответствует определенной фазе ПД и так же, как и фазы ПД, определяется состоянием проницаемости клеточной мембраны для ионов.
1. Кратковременное повышение возбудимости в начале развития ПД, когда уже возникла некоторая деполяризация клеточной мембраны. Если деполяризация не достигает критической величины, то регистрируется локальный потенциал. Если же деполяризация Достигает £кр, то развивается ПД. Возбудимость повышена, потому что клетка частично деполяризована, мембранный потенциал приближается к критическому уровню, открывается часть потенциалчувствительных быстрых Na-каналов. При этом достаточно небольшого увеличения силы раздражителя, чтобы деполяризация достигла Екр, при которой возникает ПД.
2. Фаза абсолютной рефрактерности — это полная не возбудимость клетки (возбудимость равна нулю), она соответствует пику 'Щ и продолжается 1—2 мс; если ПД более продолжителен, то более продолжительна и абсолютная рефрактерная фаза. Клетка в этот период времени на раздражения любой силы не отвечает. Не возбудимость клетки в фазы деполяризации и инверсии (в первую ее половину — восходящая часть пика ПД) объясняется тем, что потенциалзависимые w-ворота Na-каналов уже открыты и Na* быстро поступает в клетку по всем открытым каналам. Те ворота Na-каналов, которые еще не успели открыться, открываются под влиянием деполяризации, т.е. уменьшения мембранного потенциала. Поэтому дополнительное раздражение клетки относительно движения Na+ в клетку ничего изменить не может. Соответственно ПД либо совсем не возникает при раздражении, если оно мало, либо возникает максимально, если достаточно сильное раздражение (пороговое или сверхпороговое). В период нисходящей части фазы инверсии и реполяризации клетка невозбудима, потому что закрываются инактивационные ворота Na-каналов, в результате чего клеточная мембрана непроницаема для Na+, и открываются уже в большом количестве К-каналы, К+ быстро выходит из клетки, обеспечивая нисходящую часть фазы инверсии и реполяризацию. Абсолютная рефрактерная фаза продолжается в период реполяризации клетки до достижения уровня мембранного потенциала примерно Екр± 10 мВ.
Абсолютный рефрактерный период ограничивает максимальную частоту генерации ПД. Если абсолютный рефрактерный период завершается через 2 мс после начала ПД, клетка может возбуждаться с частотой максимум 500 имп/с. Существуют клетки с еще более коротким рефрактерным периодом, в которых возбуждение может в крайних случаях повторяться с частотой 1000 имп/с. С такой частотой могут возбуждаться нейроны ретикулярной формации ЦНС, толстые миэлиновые нервные волокна.
3. Фаза относительной рефрактерности — это период восстановления возбудимости клетки, когда сильное раздражение может вызвать новое возбуждение. Относительная рефрактерная фаза соответствует конечной части фазы реполяризации (начиная примерно от Екр ± 10 мВ) и следовой гиперполяризации клеточной мембраны, если она имеется. Пониженная возбудимость является следствием все еще повышенной проницаемости для К+ и избыточным выходом К+ из клетки. Поэтому, чтобы вызвать возбуждение в этот период, необходимо приложить более сильное раздражение, так как выход К+ из клетки препятствует ее деполяризации. Кроме того, в период следовой гиперполяризации мембранный потенциал больше и, естественно, дальше отстоит от критического уровня деполяризации. Если реполяризация в конце пика ПД замедляется, то относительная рефрактерная фаза включает и период замедления реполяризации, и период гиперполяризации, т.е. продолжается до возвращения мембранного потенциала к исходному уровню после гиперполяризации. Продолжительность относительной рефрактерной фазы вариабельна, у нервных волокон она невелика и составляет несколько миллисекунд.
4. Фаза экзальтации — это период повышенной возбудимости. Он соответствует следовой деполяризации. В некоторых клетках, например в нейронах ЦНС, возможна частичная деполяризация клеточной мембраны вслед за гиперполяризацией. Очередной ПД можно вызывать более слабым раздражением, поскольку мембранный потенциал несколько меньше обычного, и он оказывается ближе к критическому уровню деполяризации, что объясняют повышенной проницаемостью клеточной мембраны для ионов Na+. Скорость протекания фазовых изменений возбудимости клетки определяет ее лабильность.
Лабильность, или функциональная подвижность, — скорость протекания одного цикла возбуждения, т.е. ПД. Лабильность ткани зависит от длительности ПД: лабильность, как и ПД, определяете скоростью перемещения ионов в клетку и из клетки, которая, i свою очередь, зависит от скорости изменения проницаемости клеточной мембраны. При этом особое значение имеет длительность! рефрактерной фазы: чем больше рефрактерная фаза, тем ниже лабильность ткани.
Мерой лабильности является максимальное число ПД, Komopot ткань может воспроизвести в 1 с. В эксперименте лабильность исследуют в процессе регистрации максимального числа ПД, которое может воспроизвести клетка при увеличении частоты ритмического раздражения.
Лабильность различных тканей существенно различается. Так лабильность нерва равна 500 — 1000 имп/с, мышцы — около 200 имп/с, нервно-мышечного синапса — порядка 100 имп/с. Лабильность ткани понижается при длительном бездействии органе и при утомлении, а также в случае нарушения иннервации.
Следует отметить, что при постепенном увеличении частоты ритмического раздражения лабильность ткани повышается, т. е. ткань отвечает более высокой частотой возбуждения по сравнению с исходной частотой. Это явление было открыто в 1923 г. А. А. Ухтомским и получила название усвоение ритма раздражения.
Оценка возбудимости клетки. Аккомодация
Возбудимость клетки изменяется не только в процессе возбуждения, но и при изменении химического состава внеклеточной жидкости (в результате длительной высокой активности клеток отклонения показателей внутренней среды в патологических случаях). Если ПП медленно уменьшается, например при недостатке кислорода или под действием миорелаксантов типа сукцинилхолина, развивается инактивация Na-каналов, и клетка становите невозбудимой. При снижении концентрации ионов Na+ вне клетки этот ион в меньшем количестве входит в клетку, в результате чего снижается ее возбудимость из-за гиперполяризации. Это наблюдается при бессолевой диете, при этом может развиваться мышечная слабость. Повышение внеклеточной концентрации NaH вызывает противоположный эффект типа повышения тонуса сосудов вследствие повышения возбудимости нервно-мышечных элементов. Возбудимость различных тканей сама по себе различна у нервных клеток выше, чем у мышечных, что используется в клинической практике (при выяснении причины двигательных нарушений). Показателями состояния возбудимости ткани являются пороговый потенциал, пороговая сила, пороговое время.
Пороговый потенциал (AV) — минимальная величина, на которую надо уменьшить мембранный потенциал покоя, чтобы вызвать возбуждение (ПД). AV и возбудимость клеток находятся в обратных соотношениях: небольшая величина AV свидетельствует о высокой возбудимости клетки. Если уменьшение мембранного потенциала (частичная деполяризация) на 5 —10 мВ вызывает возникновение ПД, то возбудимость клетки высока. Напротив, большой AV (30 — 40 мВ) свидетельствует о более низкой возбудимости клетки. Однако во всех случаях ПД возникает только при достижении критического уровня деполяризации клеточной мембраны Екр (КУД).
Критический уровень деполяризации Екр (КУД) — это минимальная деполяризация клеточной мембраны, при которой возникает ПД. Дальнейшее раздражение клетки и искусственное снижение ПП ничего не изменяют в процессе возникновения ПД, поскольку деполяризация клетки, достигнув критической величины, сама по себе ведет к открытию потенциалзависимых т-ворот Na-каналов, в результате чего Na+ устремляется в клетку, ускоряя деполяризацию независимо от действия раздражителя. Критический уровень деполяризации клеточной мембраны обычно составляет около —50 мВ. При величине ПП, например, до —60 мВ (Е0), деполяризация (уменьшение ПП на 10 мВ) приведет к достижению £кр (-50мВ) и возникнет ПД. Если ПП равен —90 мВ, то для вызова ПД надо снизить ПП на 40 мВ. В последнем случае возбудимость клетки значительно ниже.
Таким образом, AV= Е0 - Екр.
Соотношения между ДУ, Е0 и Екр: наибольшая возбудимость при наименьшем AV, наименьшая возбудимость при наибольшем AV. AV мало зависит от критического уровня деполяризации Екр, но существенно — от ПП клетки Е0, поскольку Екр, как отмечалось выше, величина довольно постоянная.
Величина ПП изменяется в различных условиях деятельности клетки, вследствие этого изменяется и ее возбудимость, например при изменении концентрации Са2+, рН среды. Когда концентрация Са2+ в среде повышается, клетка становится менее возбудимой, поскольку возрастает мембранный потенциал, вследствие Чего Е0 удаляется от Екр, а когда концентрация Са2+ снижается, возбудимость клетки возрастает, так как мембранный потенциал. Уменьшается, Е0 приближается к Екр. Такое повышение возбудимости лежит в основе синдрома тетании, связанного с дефицитом Са2+ в крови. Изменения содержания ионов Н+ в среде действуют на возбудимость нейронов так же, как изменения концентрации Са2+, что в обоих случаях объясняется изменением величины Е0. Однако если мембранный потенциал снижается медлен-. но, ниже Екр (—50 мВ), например в условиях гипоксии или охлаждения, то клетка становится невозбудимой вследствие инактивации Ка+-каналов и невозможности достичь Екр.
Несмотря на то что ДУ является наиболее точным показателем состояния возбудимости клетки, используется он в эксперименте из-за сложности процедуры реже, чем другие показатели. Чаще всего возбудимость оценивается по пороговой силе раздражителя.
Пороговая сила — наименьшая сила раздражителя. Сила раздражителя — понятие собирательное, оно отражает степень выраженности раздражающего воздействия стимула на ткань. Например, сила электрического тока выражается в амперах (А), температура среды — в градусах (°С), концентрация химического вещества — в миллимолях на 1 л, сила звука — в децибелах (дБ) и т. д. При использовании в качестве раздражителя электрического тока предложенное определение пороговой силы совпадает с понятием «реобаза». Реобаза — это наименьшая сила тока, способная вызвать импульсное возбуждение. Если возбудимость ткани высока, пороговая сила раздражителя мала. Чем выше возбудимость, тем ниже пороговая сила. Большая пороговая сила свидетельствует о низкой возбудимости ткани. При внутриклеточном раздражении пороговая сила электрического тока для различных клеток равна 10~7— 10~9 А. При медленно нарастающей силе раздражителя возбуждение может не возникнуть даже при достижении большой его силы, значительно превосходящей пороговую (закон Дюбуа —Реймона, 1845). Это свидетельствует о том, что возбудимость ткани в таких условиях уменьшается, так как возникает явление аккомодации.
Аккомодация — это понижение возбудимости клетки и амплитуды ПД вплоть до полного его отсутствия при медленно нарастающем стимуле (малая крутизна). Главной причиной аккомодации является инактивация Na-каналов, возникающая при медленной деполяризации клеточной мембраны, которая длится в течение 1 с и более. Клетка теряет возбудимость если закрывается около 50% инактивационных /г-ворот (в покое //-ворота в основном открыты, закрыто около 20%). Меньшую роль играет активация К-каналов. Возникающая частичная деполяризация клетки при медленно нарастающей силе стимула ведет к уменьшению мембранного потенциала. Поэтому если и возникает ПД при дальнейшем резком увеличении силы раздражителя, то его амплитуда мала. Аккомодация развивается, например, в клетках ЦНС, когда они деполяризуются при суммации медленно нарастающих синапти-ческих потенциалов. Скорость развития аккомодации у разных тканей различна, она зависит, как и скорость возникновения ПД, от скорости активации и инактивации ионных каналов и в первую очередь, от инактивации Na-каналов. Таким образом, аккомодация характеризует не возбудимость ткани, а изменение возбудимости ткани при действии плавно нарастающего раздражителя. Поэтому при определении возбудимости ткани в качестве раздражителя необходимо использовать прямоугольные импульсы. В этом случае скорость нарастания стимула и активация Na-каналов опережают скорость аккомодации (инактивации Na-каналов), что и приводит к возникновению ПД. Важным условием, обеспечивающим возникновение возбуждения при действии раздражителя, является его длительность. Поэтому для оценки свойств возбудимой ткани вводится еще одно понятие — пороговое время.
Пороговое время — минимальное время, в течение которого Должен действовать на ткань раздражитель пороговой силы, чтобы вызвать ее возбуждение. Пороговое время называют также полезным временем, так как раздражитель обеспечивает деполяризацию только до критического уровня Екр. Далее ПД развивается независимо от действия раздражителя, дальнейшее раздражение уже становится ненужным — бесполезным. В эксперименте, в клинической практике для оценки свойств возбудимой ткани чаще используют не пороговое время, а хронаксию. Это связано с тем, что определение порогового времени затруднено. Хронаксия — это наименьшее время, в течение которого должен действовать ток в две реобазы, чтобы вызвать возбуждение. Хронаксия соответствует крутой части кривой силы — времени, она колеблется от сотых долей миллисекунд до сотен миллисекунд. Измерение хронаксии в клинической практике позволяет уточнить характер повреждений мышцы при травмах. В норме фактически определяется хронаксия нервных волокон, так как возбудимость их выше. В случае повреждения нерва и его перерождения определяется истинная хронаксия мышцы, которая оказывается во много раз больше хронаксии до травмы.
Взаимозависимость между временем действия раздражителя и сверхпороговой силой, необходимой для вызова возбуждения. Кривая в виде гиперболы (кривая Гоорве-га—Вейса—Лапика) демонстрирует, что с увеличением времени действия раздражителя его сила, необходимая для вызова возбуждения, уменьшается и наоборот. Из графика (правая часть) следует, что если для получения возбуждения использовать раздражитель по амплитуде меньше реобазы, возбуждение ткани не возникнет даже в случае бесконечно большого времени его действия. Однако, если для получения возбуждения использовать раздражитель, длительность которого будет меньше некоторого критического интервала (левая часть графика), возбуждение ткани также не будет получено даже в случае бесконечно большой силы раздражителя. Поэтому высокочастотный переменный ток (> 10 кГц) опасности для организма не представляет: при сверхкоротком воздействии на ткань импульс электрического тока дает лишь тепловой эффект, что используется в клинической практике для глубокого прогревания тканей при различных патологических процессах. Низкочастотный переменный синусоидальный ток (50 Гц) стимулирует возбудимые ткани. Стимулы синусоидального тока частотой 50 Гц большого напряжения опасны для жизни, так как они могут вызвать фибрилляцию сердца с летальным исходом.
В учебниках и руководствах по физиологии нередко встречаются термины «порог раздражения» и «порог возбуждения», под которым понимают минимальную интенсивность или минимальную энергию раздражения, способную вызвать возбуждение. Следует заметить, что понятие «интенсивность раздражения» не определено в количественном отношении. Понятие «порог раздражения» или «порог возбуждения» как минимальная энергия без указания времени действия раздражителя тоже не позволяет определить возбудимость ткани, поскольку при длительном действии слабого (подпороговой силы) раздражителя можно израсходовать большое количество энергии, но возбуждение ткани так и не вызвать. В этом случае деполяризация не достигнет критического уровня £ Кроме того, возникнет явление аккомодации, т.е. инактивация Na-каналов, которая, как известно, развивается быстро. Необоснованно также рассматривать термин «пороговая сила» как величину, зависящую от времени ее действия, что нередко допускается. Пороговая сила не может зависеть от времени действия, она зависит только от возбудимости ткани. При определении пороговой силы время ее действия не ограничивают. Сверхпороговая сила, действительно, связана со временем ее действия: чем она больше, тем короче время ее действия, необходимое для вызова возбуждения.
Действие постоянного тока на ткань
При действии постоянного тока средней силы на ткань возбуждение возникает только в момент замыкания и в момент размыкания цепи. Это закон полярного действия тока (Пфлюгер, 1859). Возбуждение возникает в момент замыкания под катодом, а в момент размыкания — под анодом. Это демонстрируется в опыте на нервно-мышечном препарате лягушки с раздражением нерва, один участок которого умерщвлен. Один электрод устанавливают на умерщвленный, другой — на интактный участок нерва. Если интактного участка нерва касается катод, то возбуждение нерва и сокращение мышцы возникает только при замыкании цепи постоянного тока. Если интактного участка нерва касается анод, то сокращение мышцы возникает только при размыкании электрической цепи.
При раздражении с помощью электрода, введенного в клетку, возбуждение ее возникает только в том случае, когда катод размещается снаружи, а анод — внутри клетки. При обратном расположении полюсов ПД не возникает, так как в этом случае возникает не деполяризация, а гиперполяризация клеточной мембраны.
В области действия катода на ткань возникает частичная деполяризация клеточных мембран, так как катод — отрицательный электрод, а клеточная мембрана снаружи имеет положительный заряд. Если деполяризация достигает Екр, то возникает ПД, вследствие лавинообразного движения ионов Na+ внутрь клетки. В области действия анода, напротив, возникает гиперполяризация клеточной мембраны, Е0 удаляется от Екр, поэтому ПД при замыкании цепи не возникает. Почему же возникает ПД под анодом в момент размыкания цепи постоянного тока? При действии анода Екр смещается в сторону гиперполяризации и может сравняться с исходным Е0. При размыкании электрической цепи на аноде мембранный потенциал быстро возвращается к исходному уровню и, естественно, достигает критической величины, в результате чего открываются потенциалзависимые активационные w-ворота Na-каналов и возникает ПД-анодное размыкательное возбуждение.
Отметим, что если сила электрического тока мала и не вызывает возникновения ПД, то в области действия катода возбудимость ткани сначала повышается — физиологический электроток, а затем падает катодическая депрессия. Возбудимость повышается вследствие уменьшения мембранного потенциала и приближения его к Екр, открывания части т-ворот Na-каналов. Главной причиной католической депрессии является развивающаяся инактивация Na-каналов (при этом Екр смещается вверх, в сторону деполяризации). Активация К-каналов играет меньшую роль. Таким образом, механизмы рефрактерности во время возбуждения ткани, аккомодации при медленно нарастающем стимуле и катодической депрессии при длительном действии тока в основном совпадают.
В области действия анода постоянного тока в ткани развиваются противоположные изменения: возникает гиперполяризация клеточной мембраны (мембранный потенциал увеличен), вследствие чего возбудимость клетки снижается. Это снижение возбудимости называют физиологическим анэлектротоном. Затем возбудимость ткани повышается в результате смещения Екр в сторону Е0 и приближения его к исходному Е0. Поэтому для достижения критического уровня деполяризации мембраны в этот момент достаточно небольшой ее деполяризации.
|