Курсовая работа: Біологічно активні речовини рослинного походження з антибіотичними властивостями

Курсова робота

Біологічно активні речовини рослинного походження з антибіотичними властивостями

ВСТУП

Застосування рослин для лікування численних недуг людини почалося з незапам’ятної давнини. Ще Гіппократ був переконаний, що використовувати рослини потрібно в їх природньому стані, без жодних перетворень. Давньоримський лікар Гален радив подрібнювати рослини, виготовляти з них екстракти та настойки на спирті, оцті, що широко застосовуються і в наш час.

Незважаючи на бурхливий розвиток хімії і зростання кількості нових, дедалі ефективніших синтетичних лікарських препаратів, антибіотиків, лікарські рослини продовжують займати значне місце в арсеналі лікувальних засобів.

Профілактика і лікування гнійно-септичних інфекцій надалі однією із складних і актуальних проблем сучасної медицини. Широке використання антибактеріальних препаратів не лише не виправдало покладених на них надій, але й створило ряд нових проблем, які потребують невідкладного вирішення. Це, насамперед, високі темпи набування гноєтворною мікрофлорою антибіотикорезистентності. В основі цього процесу лежить безконтрольне і часто недостатньо аргументоване застосування антибіотиків у клінічній практиці.

До небажаних і в той же час поширених наслідків антибіотикотерапії відносяться алергічні реакції і прямий токсичний вплив антибактеріальних препаратів на макроорганізм, який розвивається у зв’язку з органотропною фармакодинамічною дією.Тому багато синтетичних протимікробних засобів не було впроваджено в клінічну практику, а частина з існуючих має досить обмежене застосування.

Таким чином, є всі підстави для пошуку нових джерел протимікробних засобів, одними з яких можуть бути екстракти з рослин. Особливість екстрактів із лікарських рослин полягає в тому, що їх біологічно активні речовини знаходяться у певному співвідношенні, що сприяє оптимальному впливу на організм людини. Деякі складові компоненти рослинних екстрактів за хімічною структурою подібні до фізіологічно активних речовин організму (гормонів, вітамінів, ферментів тощо).Тому такі природні ліки більш активно включаються в біохімічні процеси людського організму, ніж ліки синтетичні, що є чужими для організму. На відміну від традиційних антибактеріальних препаратів, більшість антибіотиків рослинного походження, крім протимікробної дії, спричиняють виражений позитивний вплив на макроорганізм.

Фітонцидами були названі продуковані рослинами бактерицидні, фунгіцидні і протистоцидні речовини, що являються одним із факторів їх імунітету і відіграють роль у взаємовідносинах організмів у біоценозах. Велика кількість летких фітонцидів виділяються в атмосферу листяними і особливо хвойними деревами — декілька кілограмів за добу на площі 1га лісу. Ще в перші роки досліджень було встановлено, що наявність фітонцидів властива не якійсь конкретній групі рослин, а всьому рослинному світу.

Будь-який фітонцид володіє антибіотичними властивостями, але не кожен антибіотик ідентичний фітонциду окремої рослини.

Екологічний підхід до появи фітонцидів і препаратів з них (антибіотиків) дав можливість пояснити ряд питань, наприклад, чому пеніцилін менш токсичний для організму людини, ніж стрептоміцин.

З біологічної точки зору, лікування антибіотиками людини ─ це додавання до імунологічних можливостей організму людини властивостей рослин, що обумовлюють її імунітет.Тому фітонциди ─ не випадкове явище, це еволюційно вироблена властивість рослин.

Різний підхід до найменування антимікробних властивостей фітонцидів і екстрактів із рослин обумовлений тим, що при будь-якій екстракції можливі різноманітні зміни складу і структури речовин, які знаходяться в рослинах, у зв”язку з цим екстракти не завжди можуть містити природні продукти рослинного організму. Тим не менш, екстрагування є способом отримання стабільних антимікробних препаратів і відбору продуцентів антибіотиків.

Отже, рослини є перспективним джерелом для отримання протимікробних засобів. У зв’язку з цим важливе значення має наявність достатньої кількості лікарської рослинної сировини для їх виготовлення. Україна і, зокрема Прикарпаття та Карпати, завдяки своїм природно-кліматичним умовам є одним із регіонів Європи, багатих на екологічно чисті лікарські рослини.

Недостатньо вивченою на сьогоднішній день залишається дія біологічно активних речовин рослинного походження на умовно-патогенні Грам-позитивні та Грам-негативні мікроорганізми. Літературні дані свідчать про вивчення дії цих речовин стосовно широкого спектру видів різних бактерій, в тому числі і умовно-патогенних . Але в переважній більшості цих досліджень використовувалися колекційні штами перелічених бактерій. Вони протягом десятиліть культивуються в лабораторних умовах, без контакту з людським організмом, а тому характеризуються ослабленим патогенним потенціалом.

Як теоретичне, так і практичне значення представляє вивчення впливу біологічно активних речовин рослинного походження на умовно-патогенні мікроорганізми, виділені з клінічного матеріалу, передусім їх госпітальні штами, яким властива підвищена вірулентність, а також поліантибіотикорезистентність.

Зокрема, мною були проведені дослідження рослинних екстрактів (спиртових: 70% і 90%, ацетонових), а також офіцинальних настоянок відносно різноманітних штамів стафілокока.

Метою даної роботи є проведення пошуку біологічно активних речовин рослинного походження з антибіотичними властивостями відносно стафілокока, інфекція якого характеризується багатоманітною ─ від найтяжчих, генералізованих форм до легких: сепсис, пневмонія, менінгіт, абсцеси внутрішніх органів, ентероколіт, ендокардит, гінекологічні захворювання, стафілококова інфекція із скарлатиноподібним синдромом гнійно-запальні захворювання шкіри і м’яких тканин тощо. Ці пошуки проводяться серед рослин карпатського регіону, перспективних для створення нових вітчизняних протимікробних препаратів.

Розділ I . Методи досліджень .

1.1.Методичні матеріали та об’єкти , необхідні для роботи .

1.1.1Лікарська рослинна сировина і методи її екстрагування.

Досліджувалась досить велика кількість екстрактів із лікарських рослин, зібраних на території Івано-Франківської, Львівської та Закарпатської областей. Із рослин та різних їх частин (листків, стебел, квіток, коренів, кори) готувались витяжки різними розчинниками: спиртом ( 40%, 70%, 90%), ацетоном. У ряді випадків витяжки випаровувались до визначеної густини; в інших випадках рослини оброблялися звичайним для виділення алкалоїдів способом. Діюча речовина осаджувалась, відділялась від рідини, висушувалась, і в подальшому з неї готувались розведення, необхідні для досліджень.

1.1. 2 .Поживні середовища, обладнання.

Для визначення чутливості бактерій до антибіотиків використовують такі середовища:

№1. 1000 мл бульйону Хоттингера , з вмістом 120-140 мг амінного азоту ,15 г агару , 3 г натрію фосфату двозмінного ;

№2. 1000 мл м′ясопептонного бульйону (1:2), 15 г агару ,3 г натрію фосфату двозмінного ;

№3. АГВ (сухий порошок розводимо відповідно до вказівки на етикетці).

Для проведення скринінгових досліджень заготовляють поживні середовища за певним принципом . У стерильну чашку Петрі рівномірно заливають щільне поживне середовище об’ємом 30 мл. Потім вирізають у ньому лунки однакової місткості . Засівають на чашку суспензію однієї культури , а потім в лунки вносять почергово екстракти рослин.

Для посіву досліджуваних культур на щільне поживне середовище з антибіотиками використовують штампи-реплікатори на 25 чи 50 культур.

Об’єм бактеріальної суспензії чи іншої рідини, залишеної штифтом штампа-реплікатора на відбитку поживного середовища становить 0.001-0.002 мл.

Штамп-реплікатор забезпечує стандартність результатів, зменшує число помилок і скорочує затрати часу на посів, і затрату поживних середовищ у порівнянні з іншими способами посіву.

Для посіву, позначення культур і обліку результатів застосовують трафарет на 25 чи 50 зон. Це клаптик паперу формою і величиною, рівно дну чашки Петрі. Так відбивають змочені тушшю штифти репліка тора. Місця нумерують від 1 до 25 чи 50 . Замість штампа-реплікатора можна використовувати пастерівську піпетку.

Для виконання методики необхідний термостат на 37 гр.С, побутовий холодильник +3 --5 гр.С, штативи, що не псуються при стерилізації, бактеріологічні чашки діаметром 9,5 см , бактеріологічні пробірки, преципітаційні пробірки, пастерівські і мірні піпетки, аналітичні терези, анатомічні пінцети, водяна баня, 0,5%-ний розчин NaCl, 10%-ний розчин желатину, дистильована вода.

1.1.3.Приготування поживних середовищ з антибіотиками .

При визначенні показника клінічної стійкості бактерії 1мл поживного середовища повинен містити концентрацію, рівну ¼ робочої (рекомендованої для застосування на практиці) концентрації антибіотика. Більш низька в порівнянні з робочими концентрація антибіотика в поживному середовищі вибрана на основі спеціальних досліджень, які показали, що після внесення антибіотика в біотоп проходить швидке зниження його концентрації.

Для приготування середовищ з антибіотиками в залежності від об’єму роботи заготовляють певну мірну кількість поживного середовища (15, 30, 45, 60, 90 мл) у пробірках чи мірних колбах.

Для антибіотиків, випущених промисловістю у сухому вигляді (порошок), в середовище вносять наважки препаратів, для рідких форм ─ певні визначені об”єми насичених чи розведених розчинів. Якщо необхідно вихідні розчини розбавити, то використовують стерильну дистильовану воду.

Розплавлене поживне середовище після внесення антибіотика ретельно перемішують і розливають в 1-2 або більше чашок.

На дні стерильних чашок, приготованих для розливу агару, відмічають „верх” (нанесення прямої лінії на відстані 1см від краю), вказують назву і концентрацію антибіотика, номер партії. Готові чашки з антибіотиками можна зберігати в холодильнику тиждень. Перед посівом чашки обов”язково підсушують у термостаті протягом 30-40 хв.

При визначенні МІК (мінімальна інгібуюча концентрація) використовують метод серійних розведень препаратів у щільному поживному середовищі. Для цього готують серію поживних середовищ з різними концентраціями антибіотиків. Інтервал між концентраціями може бути подвійним. В залежності від активності антибіотика, вибирають ряд концентрацій ─ від мінімальної, на якій ростуть всі штами певного виду, до максимальної, яка подавлює ріст всіх штамів даного виду.

1.1.4.Відбір і підготовка культур для дослідження

При дослідженнях в цілях вибору препаратів використовують штами від хворих з нагноєнням ран слизових оболонок, шкіри, підшкірної клітковини.

Для дослідження беруть чисті культури бактерій. При закритих процесах із одного патологічного матеріалу досліджують 2-3 культури кожного виду, що має етіологічне значення; із відкритих (зв”язаних з порожнинами або зовнішнім середовищем) патологічних процесів, в яких популяція бактерій більш гетерогенна, вибірка повинна бути більшою ─ 5-10 культур.

Якщо досліджується одна культура, помилка у визначенні чутливості може досягти 50%. При великій затраті антибіотика і поживного середовища помилка не збільшується, оскільки одного виду і виділені з одного матеріалу, можна змішувати і випробовувати в одній пробі (на одній чашці з поживним середовищем може бути досліджено на чутливість до антибіотиків 25-50 культур).

Досліджувані культури вирощують в термостаті протягом 18-20 годин на скошених поживних середовищах. Ріст культур змивають теплим стерильним розчином NaCl з 0.1%-ним розчином желатину і стандартизують до 850млн. бактерій на мл (бактеріальний стандарт №10).

Культури одного виду і з одного матеріалу досліджують окремо або готують із них суміш в рівних об’ємах, так, щоб в 1мл суміші була така ж густина (850млн/мл).

1.1.5.Техніка посіву досліджуваних культур на середовище з антибіотиками.

Перед посівом досліджуваним культурам присвоюють номери трафарету, які заносять у протокол досліджень. Відомі 2 варіанти, які дають ідентичні результати.

Посів штампом-реплікатором.

Досліджувані культури пастерівською піпеткою вносять у лунки основи штампа-реплікатора. Порядок внесення культур повинен відповідати присвоєним їм, згідно трафарету, номерам.

Штифти штампа-реплікатора занурюють в лунки і ними роблять відбиток (для цього штифти злегка притискають до поверхні середовища і витримують 10с) на середовищі з антибіотиками: по одній чашці на кожен антибіотик при визначенні показників клінічної і біологічної стійкості, і на серію чашок з кожним антибіотиком при визначенні МІК. Для стандартної посівної дози штифти занурюють в лунки з культурою перед кожною реплікою. При серійному способі посів проводять від меншої концентрації до більшої. Одночасно роблять контрольний посів на поживне середовище без антибіотика.

Посів пастерівською піпеткою.

На фоні трафарету на 25 штамів відкритим кінцем стерильної преципітаційної пробірки в поживне середовище з антибіотиком роблять невеликі вдавлення ─ стандартизуючі зони посіву.

Для посіву піпеткою вихідну культуру (850млн/мл) розводять 0.5%-ним розчином NaCl у 2 рази (до густини 425млн/мл). В зони посіву пастерівською піпеткою вносять по одній краплі суспензії досліджуваних культур. Валик, зроблений пробіркою, попереджає можливість розтікання краплі. На кожну культуру беруть окрему піпетку.

Посіви витримують на лабораторному столі до всмоктування культур, після чого поміщають в термостат при температурі 37гр.С до наступного дня.

Облік результатів проводять по наявності або відсутності росту бактерій в зонах посіву на фоні трафарету з номерами культур і у відповідності з контрольним посівом. Культура, що не дала росту на середовищі з антибіотиком, оцінюється як чутлива до даної концентрації, а культура, що виросла на середовищі з антибіотиком (навіть окремі колонії), ─ як стійка.

1.1.6.Диференціація бактерицидної та бактеріостатичної дії антибіотика.

Описана вище методика не дозволяє встановити тип дії (бактеріостатичний чи бактерицидний) антибіотика. З цією метою було запропоновано метод повторних реплік-ререплік, який застосовують через добу після інкубації культур на середовищах з антибіотиками. Штифти стерильного штампа-реплікатора ретельно притискають до зон реплік з ростом і без росту досліджуваних культур і наносять відбиток (ререпліку)

на чашку Петрі з поживним середовищем, що не містить антибіотика. Посіви поміщають у термостат і порівнюють результати по наявності чи відсутності росту на обох чашках.

При бактеріостатичній дії препарату на середовищі без антибіотика в зоні відбитку буде спостерігатися повторний ріст бактерій, при бактерицидній дії зона відбитку буде залишатися стерильною.

Слід відмітити, що при використанні погано очищених штифтів штампа-реплікатора сила їх поверхневого натягу (змочуваність) зменшується, і внаслідок цього на поверхню середовища наносять менший об”єм бактеріальної суспензії, що може привести до помилкового заключення про чутливість культури до антибіотика.

Для попередження цього ускладнення необхідно після кожного досліду кип”ятити штампи-реплікатори в дистильованій воді і механічно очищати штифти штампа-релікатора.

1.2.Характеристика мікроорганізмів роду Staphylococcus як об’єкту дослідження.

1.2.1.Систематичне положення .

Стафілококи як і інші бактерії відносяться до царства Прокаріот ( Prokariotae ); Відділ Сильношкірі (Firmicutes ) – Грам-позитивні організми, за формою коки, розмножуються бінарним поділом; Клас Firmibacteria ; Група Грам-позитивні коки; Родина Micrococcaceae – це коки, що діляться більш, ніж в одній площині, неспороутворюючі; Рід стафілокок (Staphylococcus ) – міститься на шкірі, шкірних залозах, слизових оболонках теплокровних . Вид 1. золотистий стафілокок ( Staphylococcus aur е us ) – викликає фурункульоз, післяопераційні ускладнення, сепсис;

2. Staphylococcus epidermidis ; 3.Staphylococcus haemolyticus ;

4. Staphylococcus hominis ;

1.2.2. Загальні відомості

Стафілокок являє собою велику групу мікроорганізмів, різних за своїми ознаками. Поділ на патогенні і непатогенні штами досить умовний. Непатогенний стафілокок, який володіє слабо вираженими потенціально патогенними властивостями, у визначених умовах може стати причиною стафілококових захворювань, особливо у новонароджених, недоношених і дітей грудного віку. При зниженні загальної імунобіологічної реактивності організму, на фоні гострих респіраторних вірусних чи інших захворювань, непатогенний стафілокок може проявляти патогенні властивості і бути причиною розвитку хворіб за автоімунним механізмом.

В більшості випадків захворювання викликаються патогенними штамами золотистого стафілокока. В лабораторних умовах для культивування стафілокока користуються кров’яним, молочно-сольовим чи жовчно-сольовим агаром. В залежності від особливостей продукованого пігмента розвиваються колонії: золотисті, білі, кремові, лимонно-жовті. В бульйоні стафілокок формує рівномірну мутність, а потім пластівцеподібний рихлий осад на дні пробірки.

Стафілокок здатний ферментувати без утворення газу лактозу, глюкозу, сахарозу, маннозу, ксилолу, фруктозу, гліцерин: зброджувати молоко. Не зброджує рафінозу, дульцит, інулін, не розщеплює крохмаль. Стафілокок виділяє сірководень, не утворює індолу, відновлює нітрати і нітрити.

Стафілокок забарвлюється за Грамом позитивно. В мазках з чистої культури типовим є їх гроноподібне розміщення.

Однією із ознак патогенності стафілокока є його здатність лізуватися специфічними фагами.

У зв’язку з широким вторгненням в лікарську практику антибіотиків, а також сульфаніламідних препаратів з’явились антибіотикорезистентні штами стафілокока, що володіють патогенними властивостями. Тому стафілококова інфекція може розглядатися як одна із форм хвороби, що є причиною епідемічних спалахів серед новонароджених.

Боротьба із стафілококовими хворобами ускладнена у зв’язку з широким розповсюдженням стафілокока серед населення і в оточуючому людину середовищі. Епідеміологічно небезпечними є особливо ті носії, у яких постійно і тривалий час виявляється один і той же фаготип стафілокока.

Стафілокок відноситься до досить невибагливих мікроорганізмів, легко пристосовується до умов зовнішнього середовища, відносно швидко набуває стійкості до антибіотиків та інших лікувальних препаратів, зберігаючи при цьому свої вірулентні властивості. Встановлено, що під впливом лікування антибіотиками можливий перехід вегетативної форми стафілокока в L-форму, яка володіє здатністю персистувати в організмі і реверсувати у вихідну патогенну форму при зниженні загальної імунобіологічної реактивності організму чи у зв’язку з приєднанням інших захворювань. Стафілокок розмножується в широкому діапазоні температур (від 10 до 43 гр.С) в аеробних і анаеробних умовах на всіх простих поживних середовищах. Стафілокок найбільш стійкий до дії різних фізичних і хімічних факторів, добре переносить висихання, охолодження, високих температур, менш стійкий до дезинфікуючих хімічних засобів.

1.2.3. Джерело інфекції .

Джерелом інфекції є діти і дорослі з різними захворюваннями стафілококової етіології, а також здорові носії. Епідеміологічну небезпеку становлять діти і дорослі з гострими і хронічними захворюваннями верхніх дихальних шляхів, порожнини рота і легень (тонзиліт, фарингіт, риніт, аденоідит, гайморит, пародонтоз, трахеїт, трахеобронхіт, пневмонія), гнійними захворюваннями шкіри і підшкірної клітковини (піодермія, фурункульоз, флегмона, підшкірні абсцеси) та інші.

Стафілокок самостійно не розповсюджується у природі. Зараження об”єктів зовнішнього середовища залежить винятково від контакту з ними джерела інфекції.

В залежності від локалізації вогнища стафілокок може виділятися у зовнішнє середовище з мокротою, слизом із верхніх дихальних шляхів, грудним молоком, навколоплодовими водами, сечею, випарами, виділеннями запальних елементів шкіри, підшкірної клітковини, середнього вуха тощо.

1.2.4. Шляхи зараження

Стафілококові захворювання у дітей можуть виникати в результаті екзогенного і ендогенного інфікування. Інфікування здійснюється наступними шляхами: повітряно-крапельним (при розмові, кашлі, чхані); повітряно-пиловим ( у приміщенні з недостатньою вентиляцією, низькою якістю прибирання); контактним (прямий контакт з хворим чи бактерієносієм, через посуд, іграшки, білизну…); аліментарний (зараження стафілококом харчових продуктів, грудного молока); внутрішньоутробне інфікування (захворювання вагітних, тоді проникнення здійснюється через навколоплодові води, що надходять крізь шкіру, слизові оболонки рота, травний канал, повітроносні шляхи, при порушенні цілісності плаценти ¾ гематогенно ); аутоінфекційний шлях (перехід носійства стафілокока у захворювання).

Імунітет після перенесених стафілококових захворювань нестійкий. В механізмі розвитку імунітету важливим є як утворення антимікробних антитіл, так і антитоксичних.

1.2.5.Патогенез

В механізмі розвитку захворювань, що викликаються стафілококом, найбільш важливе значення мають стан реактивності дитячого організму і біологічні особливості збудника, здатного виробляти токсини, ферменти

та інші біологічно активні речовини.

Основними продуктами життєдіяльності золотистого стафілокока є токсини, які в залежності від особливостей дії на тканини і системи організму отримали наступні назви:

-некротоксин (викликає некроз, нагноєння в тканинах, а також тромбоз судин);

-фібринолізин (сприяє відділенню від тромбів емболів, що є повними вогнищами інфекцій );

-летальний токсин (згубно діє на окремі елементи тканин, викликає глибокі рефлекторні розлади );

-дермонекротоксин (запальні ущільнення на шкірі, що супроводжуються некрозом );

-стафілолізини або гемолізини (руйнують еритроцити );

-ентеротоксин ( викликає гастроентероколіт );

Крім токсичної дії стафілокок викликає сенсибілізацію організму, обумовлену наявністю алергічного компонента у стафілококовому токсині, він також володіє денатуруючою дією на тканини, які набувають автоантигенних властивостей.

Із ферментів, які виділяються у процесі життєдіяльності стафілококом, найбільше значення мають наступні: фібринолізин (відділяє від тромбів емболи), гіалуронідаза ( має руйнуючу дію на мукополісахарид – гіалуронову кислоту, основу сполучної речовини тканини), коагулаза (коагулює плазму крові, бере участь у формуванні первинного запального вогнища), лецитиназа (має значення для розмноження стафілокока, а також здатність підвищувати проникність клітинної стінки), пеніциліназа (знижує терапевтичний ефект пеніциліну і ампіциліну ).

Стафілокок також здатний виробляти й інші біологічно активні речовини. Так в механізмі виникнення захворювання важлива роль належить стафілококовому антикоагулянту, що перешкоджає нормальному згортанню крові; стафілококовому гемаглютиніну ( впливає на аглютинацію еритроцитів ).

У розвитку захворювання має значення утворений стафілококом антифагін, що володіє здатністю затримувати фагоцитоз.

У патогенезі різних клінічних варіантів стафілококових захворювань важливі наступні моменти:

1) масовість інфікування золотистим стафілококом;

2) локалізація , активність і довге протікання первинного вогнища, що обумовлює можливість гематогенного шляху розповсюдження стафілококу в організмі;

3) стан імунобіологічної реактивності, що визначає вираженість реакції організму на вторгнення стафілокока;

1.2.6. Основні клінічні форми

Враховуючи роль усіх, перерахованих вище факторів, а також клінічні дані, доречно розрізняти такі види стафілококової інфекції:

1) Стафілококовий сепсис : гострий, затяжний, хронічний. Це загальний інфекційний процес , при якому мікроби і їх токсини постійно або періодично поступають із місцевого ( первинного ) вогнища у кров ( чи лімфатичні шляхи ) , розносяться з потоком крові і осідають в тканинах різних органів і систем .

2) Вогнищева інфекція , що протікає із стійкою стафілококцемією , але без клінічних ознак сепсису. Вогнища стафілококової інфекції виявляються у легенях, нирках, жовчному міхурі, мигдаликах, лімфатичних вузлах, навколоносових пазухах, середньому вусі. До цієї групи хворіб належать: пневмонія, гайморит і риніт, мезотимпаніт, холецистоангіохоліт, пієлонефрит, тонзиліт, які часто супроводжуються алергічним нейродермітом, бактеріальною екземою.

3) Вогнищева інфекція ,що супроводжується транзиторною стафілококцемією. Спостерігається при гострих чи загострених захворюваннях стафілококової етіології: гостра пневмонія, тонзилогенна інтоксикація, пієлонефрит, ентерит, ентероколіт, гострий мезотимпаніт.

4) Вогнищева стафілококова інфекція без стафілококцемії. Характеризується помірно вираженими ознаками хронічної інтоксикації. Стафілокок локалізований у мигдаликах , середньому вусі, носових ходах, гортані і трахеї , бронхах, навколоносових пазухах, жовчному міхурі, уражених ділянках шкіри, слизових оболонках. Сюди відносять хронічний тонзиліт, аденоідит, рецидивуючий отит, ларинготрахеїт, бронхіт, риніт, гайморит, малі форми стафілококових захворювань.

5) Носійство стафілокока. Симптоми інтоксикації відсутні. На незміненій слизовій оболонці носових ходів, зіву часто виявляється золотистий стафілокок. Спостерігається у 30-50 % випадків здорових людей.

Розділ ІІ. Огляд літератури

Порівняно недавно, трохи більше півстоліття тому назад, в науці виникла нова проблема – проблема антибіотиків, розробка якої до теперішнього часу дала вже виключно цінні результати для лікувальної практики.

Перші продуценти антибіотиків виявлені серед нижчих рослин, грибів, актиноміцетів і бактерій, а вищі рослини довший час залишалися без уваги. Лише після того, як Б. П. Токін підняв питання про протистоцидні властивості випарів із розмножених частин свіжих рослин, створивши таким чином проблему фітонцидів, вищі рослини привернули до себе увагу, і серед них почались пошуки продуцентів антимікробних речовин .

Наявність протимікробних речовин властива багатьом рослинам. В більшості родин антимікробні препарати отримані лише із поодиноких видів, але є родини, у яких налічується значно більше видів, що можуть бути джерелом отримання цих речовин. Так, наприклад, найбільше протимікробних препаратів отримано із рослин родини складноцвітих (Asteraceae), потім розових (Rosaceae), лілійних (Liliaceae) тощо. Види рослин, що належать до однієї родини, можуть містити різні антимікробні речовини, навіть одна й та ж рослина може містити декілька різних речовин.

2.1. Найбільш поширені антимікробні речовини вищих рослин

Найбільш обширеними в даному напрямку являються роботи Осборна, який дослідив 2300 видів рослин, і виявив антибактеріальну активність лише у 160 видів, що належать до 63 родів.

Протимікробні речовини найчастіше виявлялися у жовтецевих, антибактеріальна активність яких могла залежати від наявності у них протоанемоніну. Потім йшли лілійні, до яких належать цибулі і часники, багаті алліцином чи близькими до нього сполуками.

Найбільш чутливими до антибактеріальних речовин рослинного походження виявились Грам-позитивні мікроорганізми, менш чутливими – Грам-негативні.

Антимікробні речовини представлені в рослинах найрізноманітнішими сполуками. Найбільш поширені, тобто ті, що найчастіше трапляються, будуть представлені нижче.

Ефірні олії різних рослин не представляють собою інидивідуальних хімічних речовин. До їх складу входять вуглеводи (аліфатичні і ароматичні), моно- і поліциклічні терпени та сесквітерпени, спирти, їх ефіри, альдегіди, феноли і фенолові ефіри, кетони, органічні кислоти, інколи лактони тощо. Тим не менше, кожній ефірній олії притаманні свої особливості. Літературні дані свідчать,що майже всі ефірні олії володіють в більшій чи меншій мірі вираженими бактеріостатичними властивостями. Зокрема, найбільш активними ефірними оліями відносно стафілококів виявились: Ol. Acorus calami (розведення 1:5000), Ol. Artemisia absinthii (1:1000), Ol. Carum carvi (1:2000), Ol. Cinnamonii (1:8000), Ol. Eucalypti (1:4000), Ol. Ferula sp. (1:1500), Ol. Thymus polessicus (1:10000 – 1:25000), Ol. Valerianae nitidae (1:2500 – 1:5000), Ol. Cannabis sativa (1:50000 – 1:100000) та інші.

Можливо, що використання антимікробних речовин має місце і в харчовій промисловості, оскільки багато приправ містять антибактеріально активні ефірні олії (імбир, мускатний горіх, кориця, майорана, лавр, духмяний перець, гвоздика, коріандр, аніс...).

Бальзами і смоли теж не являють собою індивідуальних речовин, а є сумішами. До бальзамів, що мають антибактеріальні властивості, відносяться відомі з давніх часів перуанський, копайський, толуанський бальзами і стіракс. До смол (смоляних кислот), що володіють протимікробними властивостями, відносять смоли із Balsamea Myrrha і Styrax benzoin, що містить бензойну і корицеву кислоти.

Органічні кислоти у великих кількостях містяться у вищих рослинах. Антимікробні властивості мають хаулмугрова і гіднокарпова, а також уснінова і галова кислоти.

Дубильні речовини, зокрема танін і галова кислота ще у давні часи використовувались як антисептики. В багатьох літературних джерелах вказано, що антимікробні властивості ряду рослин обумовлені наявністю в них саме дубильних речовин, зокрема такими рослинами є бадан товстолистий, брусниця, дйб звичайний, змійовик, перстач прямостоячий, скумпія тощо.

Так танін проявляєбактерицидну дію у розведенні 1:1000 – 1:5000, бактеріостатичну - 1:20000 – 1:100000; пірогалол у 1:2000 і 1:20000; гідрохінон у 1:500 і 1: 1000-2000; пірокатехін у 1: 3500 відповідно.

Із білків у якості антибіотика описаний лише один – пуротіонін, який виділений з невідбіленого пшеничного борошна. Він токсичний не лише для бактерій, але й для тварин, а також пригнічує розмноження Грам-позитивних бактерій.

Алкалоїди і глюкозиди виявляють найбільш виражену антимікробну дію серед усіх речовин рослин. Зокрема, на стафілококи виражений вплив мають піптанін, ізоамодендрин, анабазин, хатинін, гляуцин, дельфонін, таспін, сферофізин, гармін тощо.

2.2.Антимікробні речовини із рослин окремих родин та їх дія відносно бактерій роду стафілокок

Із рослин родини хвойних (Coniferales) такі антибіотики: піносільвін (виділений з деревини Pinus silvestris), пригнічує ріст золотистого стафілокока у розведенні 1:10000-20000; туяпліцин (деревина Thuja plicata і Thuja ocidentalis) у розведенні 1:32000; затримують ріст стафілокока водні і спиртові екстракти із ягід ялівця.

З родини злакових (Gramineae) антибактеріальну активність відносно стафілокока проявили екстракти листків кукурудзи, а також речовини, виділені із пшениці, одна з яких нагадує жирну кислоту, діє у розведенні 1:250000; інша білкової природи – пуротіонін, в 1:20000.

Пухиїн із родини осокових (Cyperaceae), а також екстракт квіткової рослини Tillandsia usneoides із родини бромелієвих (Bromeliaceae) затримують ріст золотистого стафілокока.

Рослини родини лілійних (Liliaceae) відомі таким антибіотиком як алліцин, що володіє широким спектром дії, бактеріостатична концентрація його відносно стафілокока 1:45000-125000. Подібну дію мають і його похідні. Із Allium sativum виділені сативін, дефензоат, які у розведенні 1:1000-1600 пригнічують ріст St. aureus та St. albus, також алізарин,що діє згубно у розведенні 1:50000. Із Allium odorum виділений одорін, що має антибактеріальний вплив на золотистого стафілокока. Метиленбутиролактон, виділений з Erythronium americanum і ефірна олія соку черемші (Allium ursinum) діють на стафілокока у розведенні 1:2000.

Із дуба (Quercus tinctoria) родини букових (Fagaceae) виділений флавоновий пігмент кверцетин, що діє у розведеннях 1:10000-13000.

Із хмелю родини коноплевих (Cannabiaceae) виділені гумулон і лупулон, що діють на стафілокок у розведенні 1:30000-50000 і 1:400000-650000 відповідно.

Кансатин, виділений із коноплі (Cannabis sativa), затримує ріст St. aureus у розведенні 1:10000-40000.

Речовину алкалоїдної природи, що впливала на ріст St. aureus у розведенні 1:50000із водяного перцю ( Polygonum hydropiper) з родини гречкових ( Polygonaceae).

На бактерії роду стафілокок досліджено вплив ще дуже великої кількості екстрактів рослин із різних родин. Так, про антимікробну активність флавоноїдів та їх сумішей, виділених з деяких видів квіткових рослин було повідомлено В.А.Бандюковою та ін. Вони встановили, що деякі ізофлавони ( осайїн, геністеїн...) та флавони ( кверцетин, диосметин...) володіють антибактеріальною активністю по відношенню до спорових культур та стафілококів. Пізніше ними були проведені дослідження відварів, спиртових витяжок і окремих фракцій, що містили різноманітні біологічно активні сполуки, в тому числі і полі фенольні.

Найбільшу активність по відношенню до всіх досліджуваних культур проявив відвар надземної частини Centaurea orientalis, Vicia truncatula, Alcea angulata, Malva neglecta, Scutellaria polyodon; суцвіть чи квіток Hibiscus syriacus, Forsythia intermedia, Mimosa biuncifera; із плодів Feijoa selloviana, Maclura pomifera; із кори стебел та листків Forsythia intermedia.

Виявилось, що окремих випадках антибактеріальна дія може посилюватись наявністю флавоноїдів та фенолокислот. Так, наприклад, види Ocnothera містять гіперозид, що легко піддається гідролізу в процесі обробки сировини водою чи спиртом з вивільненням кверцетину (Богаєвська, Бандюкова, 1987). Він проявляє активність по відношенню до стафілококів і спорових культур. Відомо також про високу антибактеріальну активність ізофлавона осайїну, що міститься в плодах Maclura pomifera. Виявилось, що спиртові витяжки з плодів теж пригнічують ріст стафілококів і деяких бацил

У відношенні до золотистого стафілококу № 209 і частково деяких інших мікроорганізмів Дербенцовою Н.А. та ін. вивчалась антимікробна дія рослин. Виявилось, що всі досліджувані рослини містили антибактеріальні речовини. В більшості випадків найактивнішими були фракції фенольного і кислотного характерів. Проте, у сушениці болотної і чистотілу найбільш активними виявились фракції основних і нейтральних речовин. У шавлії і череди були виділені натрій- бікарбонатом речовини , що пригнічували розмноження золотистого стафілокока в розведенні 1:200000-250000. Надзвичайно високу антибактеріальну активність (1:2500000-5000000) виявили кислі речовини звіробою. Досить високу протимікробну активність проявили деревій, буркун, сушениця болотна.

Антибактеріальна активність переважної більшості досліджених речовин знижувалась у присутності 10%-ної сироватки крові.

Найновіші дані з приводу даного питання будуть подані нижче:

Centipeda minima (Asteraceae).

Сесквітерпеневі лактони: 6-0метилакрилілпленолін, 6-0-ізобутироїлпленолін, 6-0-апгелоїлпленолін. Застосовуються в непальській медицині при синуситах.Активні відносно Bacillus subtilis i Staphylococcus aureus (Taylor RS i Towers gH).

Avena sativa L.s. Овес культурний (Poaceae).

In vitro: стимулює вивільнення IL-1, індукує продукцію IL-2, IFN-4 i секрецію IL-4 дозозалежно в культурі спленоцитів мишей. Підвищує неспецифічну резистентність тварин до інфікування Staphylococcus aureus (Estrada A).

Chromolaena moritziana (Asteraceae).

Дихлорметановий і водний екстракт листя, етилацетатний екстракт квіток. Застосовують у Венесуелі як протизапальний і очищаючий засіб для лікування захворювань шкіри. Активні відносно Staphylococcus aureus. Виявлено флавоноїди: кемпферал, 3-0-рутинозу кемпфералу, рутин, ізокверцетин, тритерпен L-амірин (Hidalgo Baez D).

Mutisia acuminata (Asteraceae).

Метанольний і водний екстракти. Активні відносно Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis (Catalano S).

Ephedra transitoria (Ephedraceae).

Хіноліновий алкалоїд транзторін з надземної частини - 4-хінолін-2карбоксильна кислота. Пригнічує ріст Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus. (Al-Khalil S).

Eutrema wasabi , Wasabia japonica (Cruciferae).

Ефірний екстракт стебел - 6-метилсульфінілгексил ізотіоціанат і його аналоги . Активні відносно Еsherichia coli, Staphylococcus aureus. (Ono H).

Entada abyssinica, Terminalia spinosa, Ximenia caffra, Azadirachta indica, Harrisonia abyssinica, Spilanthes mauritiana (Fabaceae, Combretacеае Olacaceae, Meliaceae, Asteraceae).

Екстракти кори стовбура, молодих гілок, коренів, листків володіють антибактеріальною активністю відносно стафілококів. MIC₅₀ – 0.13-8 мг/мл; МІС₉₀ – 0.5->8 мг/мл; МВС₅₀ і МВС₉₀ – 0.5-8 мг/мл (Fabry W).

Micromeria nervosa, Inula viscose, Ruscus aculeatus, Phagnalon rupestre, Ziziphus spina-christi (Asteraceae, Rhamnaceae). Спиртовий і водний екстракти активні відносно Staphylococcus aureus, Esherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Candida albicans (Ali-Shtayeh M. S).

Allium sativum (Alliaceae).

Турбідіметричним методом встановлено протимікробну активність часнику відносно всіх протестованих мікроорганізмів, що можуть передаватись через продукти харчування: Staphylococcus aureus, Streptococcus typhi, Esherichia coli та інші. Tаким чином часник рекомендується для продовження терміну зберігання напівфабрикатів (Kumar M, Berwal JS).

Piper gibbilimbum

Алкенінфеноли, гіббілімболи цитотоксичні для клітин назофарингіальної карциноми.Всі проявляють антибактеріальну активність відносно Staphylococcus epidermidis i Bacillus cereus (Orjala J).

Melaleuca

Ефірна олія володіє протимікробною активністю відносно Staphylococcus aureus, Escherichia coli (Fasagali Jt).

Commiphora tenuis Vollensa (Ефіопія).

Ефірна олія ексудату кори містить в монотерпеноїдній фракції a-пінен (60,8 %), b-пінен (8,8 %), сабінен (6,3 %), a-туєн (8,8), мононен (5,5%) 3-карен (3,7), b-мірцен (1,8), b-елемен (1,1%) – ідентифіковані сесквітерпенові компоненти. Основний тритерпеновий компонент – ацетат оменолової кислоти і ще 3 тритерпени (оман-12-єнової групи).Володіє актибактеріальною активністю відносно Staphylococcus aureus, Protey mirabilis, Escherichia coli (MIC 0,5-1%) (Asres K)

Viscum capense (Loranthaceae)

Пригнічує ріст Staphylococcus aureus (Amabeoku GJ).

Pelargonium sp. (Geraniaceae).

Ефірна олія з листя - перспективний антибактеріальний засіб для косметології. Володіє вираженою антибактеріальною активністю відносно Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis.

Активність метанольного екстракту і екстракту петролейним ефіром більша, ніж олія одержана перегонкою на парі (Lis-Balchin M).

Caffeae Beverage

Кислий екстракт високоактивний відносно Staphylococcus aureus і Streptococcus мutens 9102. (Daglia M)

Anethum lavlolens, Acorus gramineus (Umbelliferale, Araceae). Гексанова фракція метанольних екстрактів значно зменшує прояв антибіо-тикорезистентності полірезистентного Staphylococcus aureus (при тестуванні відносно ампіциліну і левоміцетину). Активна речовина – карвон виділена з Anethum lavlolens . Активна речовина з Acorus gramineus - рідка суміш, що містить фенілметиловий ефір бензойної кислоти (бензил- бензоат). Вони в концентрації 20-50 мкг/мл знижують антибіотикорезистентність при спільній інкубації з100 і 50 мкг/мл Амк і Лев відповідно (Kim H).

Alichrysum trilineatum (Asteraсеае)

Піноцимбриновий балкон володіє протимікробною активністю відносно Staphylococcus aureus (Bremner PD;Meyer JJ ).

Lycoperricon esculentum, Томат культурний (Solanaceae)

Олійний екстракт пульпи плодів володіє широким спектром протимікробної активності відносно грампозитивних і грамнегативних мікрорганізмів та грибів роду Candidis ( Enterobacter, Streptococcus, Staphylococcus, Klebsiella, Esherichia – клінічних штамів. Протимікробну активність пов’язують з комплексом органічних кислот (щавелевою, лимонною, тартаровою та ін.). (Воробьев та ін.).

Cryptostegia grandiflora (Asclepiadaceae).

Екстракт листя володіє вираженою активністю відносно St. aureus NCIM-

2492, E. coli NCIM-2345, Bac. subtilis NCIM-2349, Bac. coagulans NCIM-2323

Paulownia tomentosa

Бутанольний екстракт гілок володіє антибактеріальною активністю відносно St. aureus (sg 511,285,503), Str. pyogenes (A 308, A 77), Str. Faecium MD 8в.

Максимально активний - кампнеозид (МІС-150 мкг/мл). Встановлено, що метоксигрупа в його молекулі відіграє важливе значення для прояву антибактеріальної активності (Kang KH).

Wedelia trilobata

Етилацетатний екстракт активний відносно Bac. subtilis, Myc. smegmatis, St aureus, St. epidermidis, Pr. vulgaris, Ps. aeruginosa, Salmonella grav C, S. paratyphi, Sh. Sonnei .

Hypericum perforatum (Hypericaceae).

Гіперфорін (тритерпен) активний відносно полірезистентного St. aureus i грамнегативних бактерій (Schempg CM).

Mitracarpus scaber

Спиртовий екстракт надземної частини бенз[g]ізохінолін-5,10-діон максимально активний, проявляє добре виражену протимікробну активність, в тому числі відносно СНІД – асоційованих мікроорганізмів (Bac. subtilis, C. albicans, Cript. neoformans, M. avium, St. aureus )(Okunada AL).

Camellia sinensis

Компоненти екстракту відміняють метізилізорезистентність стафілококів. В основі морфологічних змін лежить вибіркове пригнічення пеніцилінзв’язуючих білків. (Hamilton-Miller G M).

Baccharis dracunculifolia Секрет листя, що служить джерелом бджолиного клею – прополіс,володіє антибактеріальною активністю відносно St. aureus, C. аlbicans (Bankova G).

Buddleja cordaba

Вербаскозид. За допомогою вивчення кінетики кілінгу та інкорпорації мічених попередників встановлено летальну дію на St. auricus. В її основі лежить вплив на синтез білка і зниження інкорпорації лейдину в (Avila J D).

Byrsonima crassifolia

Етилацетатний екстракт коренів – максимально активний відносно Pl. pneum, Ps. aerugin, S. typhi, Sh. flexneri, St. aureus, St. epidermidis, Str. pneumonica, M. luteus (Martinez – Vazquez M).

Senecio graveolens (Asteraceae).

Ефірна олія містить валеріановi альдегіди: a-пінен, a-феландрен, a-терпінен, Р-цімен, сабінен, g-терпінен, терпінолен, 1-метил-4-ізопропілбензол, тер-пінен-4-ол, піперпенон, a-b-еузесмол. Володіє протимікробною активністю відносно M. Luteus ATCC 9341, St. aureus, а також клінічних ізолятів C. Albicans.MIC – M. Luteus 8.73*10^-2 мг/мл; МІС – St. aureus 10.91*10^-2 мг/м; МIC – C. Albic. 2.3*10^-2 мг/мл (Perez C).

Dios pyros mespiformis (Ebenaceae) . Неочищені екстракти володіють більш широким спектром дії відносно грампозитивних і грамнегативних мікроорганізмів, деяких штамів грибів. Максимальна активність – у хлороформного екстракту коренів, до деяких вивчених екстрактів чутливі штами St. aureus і штами Ps. aeruginosa (AdeniyiBA).

Clove (Alliaceae).

Екстракт володіє бактерицидною активністю: після 1год. експозиції вбиває 93% Staph. epidermidis; 93% кілінг S. tiphi досягається через 3 години ; повний кілінг Candida досягається через 5год. з clove і через 1год. з часником (Arora в S, Kaur J).

Piper betle

Екстракт листя (етилацетатний, етанольний) володіє вираженою протимікробною акт. (методом дисків) відносно St. aureus, Str. pneumonica,Kl. aerogenes.

Combretum erythrothyllum Протимікробна активність відносно St. aureus, Ent. faecalis, E. coli, Ps. aeruginosa ( Eloff J N).

Psidium guajava

Водний екстракт листя проявляє протимікробну активність відносно St. aureus (9 різних штамів) – в лунках, методом дисків і турбідиметричний. Повне пригнічення росту всіх штамів – 6,5мг/мл (Gnan S O i Demellо).

Eysenhardtia texana Флаванони з надземної частини активні відносно St. aureus (Wachter G A).

Hypericum papuanum

Петролейно-ефірний екстракт надземної частини володіє антибактеріальною активністю відносно Bac. сereus, St. epiderm, Microc. luteus (Winkelman K).

Sophora flavescens

Значна антибактеріальна активність відносно грампозитивних бактерій - St. aureus, Bac. Subtilis, St. epidermidis, Propionibacterium acne. ( Xuroyanagi M).

Mikania micrantha

2 сесквітерпеноїди – міканоліди використовують в Ямайській народній медицині, активні відносно St. aureus i C. аlbicans (Facey P C).

Отже, як видно із великої кількості досліджень вченими різних країн світу, рослини заслуговують великої уваги відносно протимікробної активності. Саме тому дуже важливо розкрити їх ще невідомі нам різноманітні властивості.

Розділ III . Практична частина

3.1. Етапи здійснення досліджень

Досліджувалось 55 екстрактів із лікарських рослин, зібраних на території Івано-Франківської, Львівської та Закарпатської областей. Із рослин та різних їх частин (листків, стебел, квіток, коренів, кори) готувались витяжки різними розчинниками: спиртом ( 40%, 70%, 90%), ацетоном. У ряді випадків витяжки випаровувались до визначеної густини; в іншихвипадках рослини оброблялися звичайним для виділення алкалоїдів способом. Діюча речовина осаджувалась, відділялась від рідини, висушувалась, і в подальшому з неї готувались розведення, необхідні для досліджень. Антибактеріальна активність отриманих таким шляхом препаратів визначалась на тест-культурах - лабораторних і клінічних штамах Staphylococcus aureus , St . е pidermidis , St . haemolyticus , St . warneri та інших видів, виділених в лікувальних закладах м. Івано-Франківська.

Активність препаратів досліджувалась на твердих чи рідких оживних середовищах. Агар, розлитий в чашках Петрі і підсушений, засівався досліджуваною культурою, що містить 500 млн. Мікробних тіл в 1 мл.

Після добової витримки чашок в термостаті при температурі 37 гр. С проводився підрахунок по вимірюванню величини зон затримки росту культури у порівнянні з відповідними контролями (екстрагуючими речовинами).

Частина екстрактів досліджувалась у рідких поживних середовищах (головним чином на м’ясопептонному бульйоні) методом серійних розведень.

В ході роботи були застосовані такі методи дослідження:

- скринінгове дослідження екстрактів на протимікробну активність методом дифузії в агарі;

- вивчення мінімальної пригнічуючої (МПК) та мінімальної бактерицидної (МБК) концентрацій досліджуваних екстрактів, які проявили протимікробну активність, методом серійних розведень;

Було проведене скринінгове дослідження на протимікробну активність 40%, 70%, 96% етанольних і ацетонових екстрактів, виготовлених за стандартними фармакопейними методиками (табл.1) і для порівняння – офіцинальні препарати (табл..2).

Таблиця 1: Досліджувані екстракти

Таблиця 2 . Препарати контролю

Протимікробна активність вивчалась методом дифузії в агар. Бактерії засівались газоном на поверхню м’ясопептонного агару в чашках Петрі, після чого в лунки, діаметром 3 мм, вирізані в агарі, вносились досліджувані речовини. Протимікробна активність враховувалась за величиною зон затримки росту бактерій.

Визначення мінімальної пригнічуючої та мінімальної бактерицидної концентрацій проводилось методом серійних розведень екстрактів в агарі. Посів проводився з допомогою штампа-реплікатора, бактеріостатичну концентрацію визначали через добу, пересіваючиз чашки з антибіотиком на стерильну чашку без антибіотика.

3 .2. Результати скринінгових досліджень екстрактів лікарських рослин на протимікробну дію

На клінічних штамах золотистого, епідермального, гемолітичного та інших коагулазо-негативних стафілококів було перевірено наявність антибіотичних властивостей у 40%, 70%, 90% етанольних та ацетонових екстрактів рослин, поширених у Передкарпатському та Карпатському регіонах. Для порівняння досліджували також ряд офіцинальних настоянок та антисептичих препаратів, які уже широко застосовуються в медицині.

В табл. 3 і 4 наведено результати скрінінгового дослідження протимікробної активності 40% етанольних екстрактів відносно штамів золотистих і епідермальних стафілококів.

Таблиця3: Вплив 40%-них етанольних екстрактів рослин на ріст Staphylococcus aureus

Таблиця4: Вплив 40%-них етанольних екстрактів рослин на ріст штамів Staphylococcus epidermidis

Переважна більшість 40% екстрактів достовірної протистафілококової активності не проявляли. Істотне пригнічення росту St. aureus і St. epidermidis спостерігалося лише під впливом біологічно активних речовин грінделіїї розчепіреної (н/ч), біоти східної (листя і плоди) та сіверсії гірської. При цьому зони затримки росту St. epidermidis були більшими, порівняно із золотистим стафілококом. Чутливість до досліджених препаратів у штамів золотистого стафілокока була індивідуальною, вона не залежить від рівня їх антибіотикорезистентності. Чутливий до антибіотиків штам епідермального стафілокока характеризується вищою чутливістю до екстрактів полину звичайного, водянки чорної та живокосту лікарського, ніж антибвотикорезистентні штами.

Проведено також дослідження 70 % етанольних екстрактів, результати яких подані у таблицях 5 і 6.

Із 70% етанольних екстрактів найбільшу активність проявили біологічно активні речовини гірчака зміїного та верби білої. Чутливість штамів обидвох видів стафілококів виявилась подібною. Штам золотистого стафілокока, чутливий до антибіотиків, також проявив слабку чутливість і до деяких інших екстрактів, зокрема болиголову плямистого, нечуйвітра оранжево-червоного, підмаренника м’якого. Індивідуальну чутливість виявив антибіотикорезистентний штам St. epidermidis до болиголову плямистого. Резистентні штами особливої чутливості до70% етанольних екстрактів не проявляли. В даному випадку штами епідермального стафілокока виявились менш чутливими до антимікробних речовин рослинного походження, ніж штами золотистого, що є не зовсім харакерним для нього, оскільки в інших дослідженнях Staphylococcus epidermidis проявляє більшу чутливість.

Таблиця 5 : Вплив 70%-них етанольних екстрактів рослин на ріст Staphylococcus aureus

Таблиця 6: Вплив 70 %-них екстрактів на ріст Staphylococcus epidermidis

У таблицях 7 та 8 наведені результати протимікробної активності 90% етанольних екстрактів, які проявили найкращу дію відносно стафілококів. Екстракти лікарських рослин, виготовлені на 90% етанолі, в цілому значно активніші відносно стафілококів, ніж 40% екстракти. Найбільші зони затримки росту золотистого стафілокока дають екстракти гринделії розчепіреної, софори, чистотілу більшого, омели білої, гінкго дволопатевого, гірчака зміїного, ісландськогомоху та біоти східної. При дослідженні гірчака зміїного виявилося, що, на відміну від кореневищ, надземна частина рослини (листя і стебла, квіти) проти стафілококів не активна. Деякі екстракти проявляли індивідуальну активність, тобто відносно якогось конкретного штаму. Зокрема полин звичайний, смовдь таврійська, хвощ польовий, полин гіркий, яглиця зичайна та інші. Епідермальний стафілокок проявив більшу чутливість до 90% етанольних екстрактів, ніж золотистий. Це спостерігалося при вимірюванні діаметру зон затримки росту, яка була значно більшою, а також при дії екстрактів із більшої кількості рослин. Зокрема, на штами епідермального стафілокока значний вплив мали екстракти чистотілу більшого, сіверсії гірської, гірчака зміїного, біоти східної, гінкго дволопатевого, кропиви дводомної та інших. Найбільш чутливим виявився штам, який не є рензистентним до антибіотиків.

Таблиця 7: Вплив 90%-них екстрактів рослин на ріст Staphylococcus aureus

Таблиця8: Вплив 90%- них етанольних екстрактів рослин на ріст Staphylococcus epidermidis

Крім етанольних екстрактів також було проведено дослідження на антимікробну дію ацетонових та ацетон-етанольних екстрактів лікарських рослин. Вони подібно до екстрактів, виготовлених на 90% етанолі, теж проявили досить високу активність відносно стафілококів. Найбільші зони затримки росту золотистого стафілокока дають екстракти кермеку широколистого, гінкго дволопатевого, гірчака зміїного, мучниці, вербени лікарської, а також брусниці. Деякі екстракти проявляли індивідуальну активність, тобто відносно якогось конкретного штаму. Штами епідермального стафілокока виявились більш чутливими, оскільки зони затримки росту були значно більшими, а також на них подіяла більша кількість рослин. Зокрема, екстракт кори дуба, коренів гірчака зміїного, кермеку широколистого та кермеку Гмеліна; надземної частини чорниці, брусниці, мучниці, вербени лікарської, буяхів, вересу, пижма звичайного; листя гінкго дволопатевого, чаю китайського.

Слід зауважити, що більшу активність відносно стафілококів проявляли екстракти, виготовлені на основі етанолу та ацетону, ніж ті, що виготовлені тільки на ацетоні . Це може бути пов”язане із тим, що розчинилась більша кількість фракцій, тому в екстракті присутня більша кількість антимікробних речовин.

Таблиця 9: Вплив ацетонових ( f ) та ацетон-етанольних ( fe ) екстрактів рослин на ріст Staphylococcus aureus

Таблиця 10: Вплив ацетонових ( f ) та ацетон-етанольних ( fe ) екстрактів рослин на ріст Staphylococcus epidermidis

Для порівняння було проведене дослідження на протимікробну активність лікарських препаратів: офіцинальних настоянок та антисептиків, які вже довший час використовуються в медицині для лікування стафілококових інфекцій. Результати свідчать, що деякі рослинні екстракти проявляють не гіршу, а інколи й кращу активність. Зокрема. екстракт коренів гірчака зміїного пригнічував ріст більшої кількості клінічних штамів стафілококів, ніж препарат хлорофіліпт, який успішно використовується при гнійниково-септичних захворюваннях. Дані досліджень показані у таблицях 11 та 12.

Таблиця 11 : Активність офіцинальних препаратів

відносно Staphylococcus aureus

Таблиця 12 : Активність офіцинальних препаратів

відносно Staphylococcus epidermidis

Отже, як видно з наведених вище результатів досліджень, найбільш яскраво виражена антибактеріальна активність спостерігалась у наступних етанольних та ацетонових екстрактів: трави гринделії розчепіреної Grindelia robusta, до якої виявились чутливі 56% штамів, діаметр зони затримки росту становив в середньому 5,83±0,28 мм; суцвіть та листків кермеку широколистого Limonium platyphyllum, що пригнічував ріст 61% стафілококів з діаметром зон затримки росту ... 0,34 мм; активними виявились листки гінкго дволопатевого Ginkgo biloba, затримуючи розмноження 58% штамів, і давши зону затримки росту 5,63±0,39 мм; непогану дію показав екстракт омели білої Viscum album, пригнітивши ріст 46% досліджуваних штамів, при цьому діаметр склав 5,46±0,31 мм; полин звичайний Artemisia vulgaris спричинив загибель 59% штамів стафілококів, із затримкою росту на 5,28 ±0,35 мм; листя і плоди біоти східної Biota orientalis дали зону затримки росту 5,84±0,29, чутливими до цього екстракту виявились 55% бактерій; також досить активним виявився екстракт сіверсії гірської Parageum montanum, що затримав ріст 52% штамів , діаметр зони затримки росту при цьому становив 5,33±0,25; серед усіх досліджуваних мною рослинних екстрактів найвищу активність проявив екстракт кореневищ гірчака зміїного Polygonum bistorta, що спричинив пригнічуючи дію на 90% штамів стафілококів, зона затримки росту становила 5,69±0,27 мм .

З офіцинальних настоянок найкращу протимікробну дію мали настоянка м”яти перцевої Mentha piperita, що пригнічувала ріст 88% бактерій, і давала зону затримки росту діаметром 6,79±0,29 мм, а також хлорофіліпт (спиртовий екстракт евкаліпта кулевидного Eucaliptus globosus), чутливими до якого виявились 63% штамів, а діаметр зони затримки росту склав 5,59±0,29 мм .

У таблиці 13 подані узагальнюючі результати, де вказані відсоток штамів, що виявились чутливими до екстракту тої чи іншої рослини, а також середній діаметр зони затримки росту.

Таблиця 13: Протимікробна активність найбільш перспективних екстрактів відносно стафілококів, виділених при гнійно-септичних процесах .

3.3. Встановлення протимікробних концентрацій екстрактів найбільш активних рослин

Протимікробні концентрації встановлювались методом серійних розведень екстрактів лікарських рослин в агарі. Потім з допомогою штампа-реплікатора на чашку Петрі наносились 25 штамів мікроорганізмів роду стафілокок. Через добу інкубації у термостаті спостерігали за ростом культур. Для визначення типу дії (статичного чи цидного) робили пересів на стерильну чашку. Якщо росту не спостерігалось, то при цій концентрації тип дії бактерицидний, якщо ж на чашці з екстрактом росту не було, а потім з”явився, то ця концентрація є бактеріостатичною.

У таблиці 14 подані результати встановлених мінімальних бактерицидних та бактеріостатичних концентрацій екстрактів рослин. Найбільш перспективнтми у цьому плані виявились екстракти коренів гірчака зміїного, що пригнічував ріст стафілококів у розведенні 1 : 128, при мінімальній інгібуючій концентрації 117 мкг/мл; сіверсії гірської, у концентрації 1563 мкг/мл, при розведенні 1 : 16; біоти східної – 1:64, 156 мкг /мл; гінкго дволопатевого – 1:32, 313 мкг /мл; гринделії розчепіреної – 1:32, 406 мкг/мл; полину звичайного –1:16, 313 мкг/мл відповідно.

Найбільш чутливими виявились штами Staphylococcus epidermidis, трохи меншу чутливість проявили штами золотистого стафілокока. Ріст штамів коагулазо-негативних стафілококів екстракти рослин пригнічували у значно вищих концентраціях.

Таблиця 14: МП К найбільш активних екстрактів рослин.

Для порівняння було проведено дослідження концентрацій фармацевтичних препаратів (табл.15). Результати досліджень показали, що їх антимікробна дія не сильно відрізняється від дії екстрактів дикоростучих рослин. Зокрема, антисептик бетадін, який протягом довгого часу успішно застосовується для лікування стафілококових інфекцій, показав результат, подібний до екстракту гінкго дволопатевого та полину звичайного – 313 мкг/мл, таку ж дію мала настоянка м’яти перцевої.

Таблиця 15: МП К найбільш активних препаратів контролю.

Штами різних видів стафілококів протягом усього періоду досліджень проявляли різну чутливість як до екстрактів із рослин, так і стосовно лікарських препаратів. На рисунку 1 подано графіки чутливості різних видів стафілококів до екстракту коренів гірчака зміїного, оскільки він проявив найвищу активність серед усіх досліджуваних екстраків. Як видно із графіків, найбільш чутливими виявились штами St. epidermidis, найбільш стійкими – штами St. hominis.

Рисунок1.

Рисунок2.

Серед аптечних препаратів найбільшу активність проявила настоянка м’яти перцевої. Чутливість до неї клінічних штамів стафілококів показана на рисунку 2. Як видно, найкращий вплив вона мала відносно штамів золотистого і епідермального стафілококів. Штами Staphylococcus hominis i Staphylococcus haemolyticus виявились досить резистентними до дії біологічно активних речовин рослинного походження. Можливо, це пов’язане із тим, що вони в основному були клінічними, тому набули високої резистентності при контакті з людським організмом.

Висновок

1. Найкращу антимікробну дію проявляли 90% етанольні, а також ацетонові екстракти.

2. Активність рослинних екстрактів відносно стафілококів спадала в такому порядку: екстракт кореневищ гірчака зміїного (пригнічував ріст 90% штамів стафілококів) > суцвіть та листків кермеку широколистого (61%) > трави полину звичайного (59%) > листків гінкго дволопатевого (58%) > трави гринделії розчепіреної (56%) > %; листя і плодів біоти східної (55%) > трави сіверсії гірської (52%) > трави омели білої (46%).

3. Серед усіх досліджуваних екстрактів найвищу активність проявив екстракт кореневищ гірчака зміїного (Polygonum bistorta), що спричинив пригнічуючи дію на 90% штамів стафілококів, у концентрації 117 мкг/мл.

4. З офіцинальних настоянок найкращу протимікробну дію мали настоянка м’яти перцевої (Mentha piperita), що пригнічувала ріст 88% бактерій, а також хлорофіліпт (спиртовий екстракт евкаліпта (Eucaliptus globosus)), чутливими до якого виявились 63% штамів.

5. Штами золотистого (St. aureus) та епідермального (St. epidermidis) стафілококів протягом усього періоду досліджень проявляли більшу чутливість у порівнянні з іншими, коагулазо-негативними видами (St. hominis, St. haemolyticus, St. warneri тощо).

Список використаної літератури

1. Бандюкова В.А. Антибактериальная активность извлечений у некоторых видов цветковых растений \\ Раст. Ресурсы, вып. 2, 1989, т. 26, с. 169-178.

2. Дербенцева Н.А., Бондаренко А.С. та ін. Антимікробні властивості лікарських рослин.,\\ Фармацевтичний журнал, 1989 №4.

3. Кретович В.Л. Биохимия растений. М., Высш. Школа, 1980.-445с

4. Мамчур Ф. И. Довідник з фітотерапії, К.: Здоров’я, 1984.- 264 с.

5. Навашин С. М., Фомина И.П. Рациональная антибиотикотерапия.-М.: Медицина, 1982.- 495с.

6. Неграш А.К. Развитие устойчивости у золотистого стафилококка к антибиотикам растительного происхождения и свойстве устойчивых вариантов. В кн.: Наукова думка, 1981, с 260-262.

7. К.Д. П’яткін, Ю.С. Кривошеїн Мікробіологія, К., Вища школа, 1992р

8. Товстуха Є. С. Фітотерапия, К.: Здоров’я, 1990.- 304с

9. А.В. Шапіро Визначення чутливості мікроорганізмів до антибіотиків методами серійних розведень та e-тесту (лекція) \\ клиническая антибиотикотерапия, 2001, №3(11), ст. 11-15.

10. Adeniyi BA, Fong HH, Pezzuto JM, Luyengi L, Odelola HA. Antibacterial activity of diospyrin, isodiospyrin and bisisodiospyrin from the root of Diospyros piscatoria (Gurke) (Ebenaceae). Phytother Res 2000 Mar;14(2):112-7

11. Batista O, Duarte A, Nascimento J, Simoes MF, de la Torre MC, Rodriguez B. Structure and antimicrobial activity of diterpenes from the roots of Plectranthus hereroensis. J Nat Prod 1994 Jun;57(6):858-61.

12. Chen H, Tan RX, Liu ZL, Zhao CY, Sun J. A clerodane diterpene with antibacterial activity from Ajuga lupulina. Acta Crystallogr C 1997 Jun 15;53 (Pt 6):814-6.

13. Digrak M, Ilcim A, Hakki Alma M.Antimicrobial activities of several parts of Pinus brutia, Juniperus oxycedrus, Abies cilicia, Cedrus libani and Pinus nigra. Phytother Res 1999 Nov;13(7):584-7.

14. Harkenthal M, Reichling J, Geiss HK, Saller R. Comparative study on the in vitro antibacterial activity of Australian tea tree oil, cajuput oil, niaouli oil, manuka oil, kanuka oil, and eucalyptus oil. Pharmazie 1999 Jun;54(6):460

15. Haznedaroglu MZ, Karabay NU, Zeybek U. Antibacterial activity of Salvia tomentosa essential oil. Fitoterapia 2001 Nov;72(7):829-31.

16. Hossain MM, Paul N, Sohrab MH, Rahman E, Rashid MA. Antibacterial activity of Vitex trifolia. Fitoterapia 2001 Aug;72(6):695-7.

17. Lis-Balchin M, Buchbauer G, Ribisch K, Wenger MT. Comparative antibacterial effects of novel Pelargonium essential oils and solvent extracts. Lett Appl Microbiol 1998 Sep;27(3):135-41.

18. Mandal SC, Nandy A, Pal M, Saha BP. Evaluation of antibacterial activity of Asparagus racemosus willd. root. Phytother Res 2000 Mar;14(2):118

19. Saeed MA, Sabir AW. Antibacterial activity of Caesalpinia bonducella seeds. Fitoterapia 2001 Nov;72(7):807-9.

20. Shrimali M, Jain DC, Darokar MP, Sharma RP. Antibacterial activity of Ailanthus excelsa (Roxb). Phytother Res 2001 Mar;15(2):165-6.

21. Taddei A, Rosas-Romero AJ. Antimicrobial activity of Wedelia trilobata crude extracts. Phytomedicine 1999 May;6(2):133-4.

22. Ulubelen A, Topcu G, Eris C, Sonmez U, Kartal M, Kurucu S, Bozok-Johansson C. Terpenoids from Salvia sclarea. Phytochemistry 1994 Jul;36(4):971-

23. Zheng WF, Tan RX, Yang L, Liu ZL. Two flavones from Artemisia giraldii and their antimicrobial activity. Planta Med 1996 Apr;62(2):160-2.

24. Zheng WF, Tan RX, Yang L, Liu ZL. Two flavones from Artemisia giraldii and their antimicrobial activity. Planta Med 1996 Apr;62(2):160-2.